Effetti delle Nanoparticelle su differenti sistemi biologici

1° LINEA DI RICERCA: Negli ultimi anni, la nanobiotecnologia sta focalizzando sempre pi๠la sua attenzione sulla progettazione di nanomateriali innovativi (nanocapsule, nanosfere, nanoparticelle ,nanotubi), da utilizzare in campo biomedico per la veicolazione di farmaci (“drug delivery”), per la terapia genica (“gene therapy”) e per la diagnostica. Per un sistema di rilascio adeguato, i punti chiave, al fine di una loro efficiente applicazione, sono rappresentati dall'efficienza di ingresso delle nanoparticelle nei tessuti bersaglio e dalle conoscenze dei meccanismi di internalizzazione e del traffico intracellulare. Tuttavia tali meccanismi hanno cominciato a essere studiati solo di recente. (Harush-Frenkelet al., 2007; Panyam et al., 2002; Rejman et al., 2004). Finora venivano mostrati dati controversi sull'internalizzazione delle NPs nelle cellule, queste discrepanze riscontrate possono essere ricondotte alle differenti NPs utilizzate, alle diverse condizioni sperimentali e sistemi biologici in vitro e in vivo. Pertanto, risultano ancora necessari ulteriori approfondimenti sui meccanismi che regolano l'internalizzazione dei nanomateriali nella cellula, al fine di modulare le diverse risposte cellulari. (SCENIHR 2007, 2009; EPA 2007; FDA 2006, 2008). Finora la maggior parte degli studi sull'”uptake” delle NPs veniva effettuata su linee cellulari immortalizzate, mentre rari erano gli studi condotti su colture cellulari primarie. Alla luce di questi dati, per superare i problemi dovuti all'utilizzo di differenti NPs e dei diversi sistemi biologici, in questo studio veniva studiata l'influenza della taglia sull'uptake di NPs “modello” di polistirene da 44 e 100nm incubate con un unico tipo di coltura cellulare primaria. A tal fine veniva analizzata la cinetica di ingresso/rilascio delle NPs, le vie di internalizzazione impiegate e la loro localizzazione intracellulare in colture primarie di cellule epiteliali oviduttali bovine (BOEC). Tali cellule costituiscono il rivestimento epiteliale dei tratti oviduttali, coinvolto nell'emissione di prodotti secretori essenziali per creare un microambiente favorevole per la maturazione ovocitaria, la capacitazione spermatica, la fecondazione e il trasporto di gameti ed embrioni (Ellington, 1991; Hunter, 2003). I dati ottenuti nel presente studio dimostrano che 1) NPs-PS 44nm vengono efficientemente internalizzate in BOEC in accordo a una cinetica di saturazione; 2) NPs-PS 100nm non vengono internalizzate in BOEC; 3) NPs-PS 44nm sono internalizzate mediante processi ATP-independenti; 4) NPs-PS 44nm non mostrano alcuna co-localizzazione con vescicole endocitotiche rivestite da clatrina o caveolina; 5) NPs-PS 44nm vengono efficientemente rilasciate da BOEC. Pertanto tali studi forniscono risultati utili alla comprensione delle caratteristiche chimico-fisiche pi๠appropriate per un efficiente e sicuro impiego delle nanoparticelle in applicazioni biomediche. Tutti questi dati nel complesso dimostrano che l'uptake e il rilascio di NPs dalle BOEC risultano fortemente dipendenti dalle loro caratteristiche chimico-fisiche, in particolar modo dalla taglia, in accordo con precedenti studi (Lai et al., 2007, Liu et al., 2011; Chithrani et al., 2006). I risultati ottenuti in tale lavoro di tesi mostrano una forte influenza della taglia delle NPs sul processo di internalizzazione cellulare, evidenziando l'importanza dell'impiego di NPs di dimensioni estremamente ridotte, al fine di poterle utilizzare come vettori biomedici o diagnostici. La taglia nanometrica di questi nanovettori offre, infatti, unici vantaggi per il “drug delivery”, quali quello di poter penetrare profondamente nei tessuti attraverso i piccoli capillari, attraversare la fenestrazione presente nel rivestimento epiteliale ed infine essere internalizzati dalle cellule (Vinagradov et al., 2002). In conclusione i dati qui ottenuti, forniscono un contributo alla comprensione dei meccanismi di internalizzazione e rilascio delle NPs e mettono in evidenza che ogni sistema cellula-NPs necessita di accurate analisi specifiche. I dati ottenuti in questi diversi sistemi permetterebbero di creare un database utile alla comprensione di tali interazioni. Dunque in futuro saranno necessari ulteriori studi finalizzati alla comprensione dei meccanismi di uptake delle NPs prima di un loro efficiente e sicuro impiego nelle diverse applicazioni terapeutiche. 2° LINEA DI RICERCA: L'uso delle NPs potrebbe anche rappresentare un rischio per la salute dei loro produttori e dei consumatori, infatti, preliminari dati evidenziavano che le NPs differiscono dal materiale di composizione per molte caratteristiche che conferiscono loro proprietà  citotossiche (Lewinski et al., 2008). A causa delle loro dimensioni estremamente ridotte, infatti, le NPs possiedono un'alta area di superficie in rapporto al volume che le conferisce un'alta reattività , la quale potrebbe portare a interazioni dannose con i sistemi biologici e l'ambiente (Oberdorster et al., 2005b). Finora la maggior parte degli studi veniva effettuata su diverse linee cellulari somatiche in vitro, dimostrando che differenti NPs erano in grado di indurre stress ossidativo (Oberdorster et al., 2005a; McCarthy, 2012), interazione col DNA (Singh et al., 2009; Mu et al., 2012), stimolazione di secrezione di proteine infiammatorie, riduzione della vitalità  e morte cellulare, in maniera dose-dipendente. (Waters, 2009; Chen et al., 2004; Cho et al., 2007; Dutta et al., 2007; Lin et al., 2006; Sayes et al., 2007). Tuttavia il comportamento delle NPs verso i sistemi biologici e i loro effetti tossici non sono finora pienamente compresi. Pertanto identificare le caratteristiche chimico-fisiche necessarie per l'utilizzo delle NPs in campo biomedico e sviluppare un predittivo e appropriato saggio di nanotossicità  per questi nuovi nanomateriali, risulta indispensabile prima del loro impiego in biomedicina (SCENIHR 2007, 2009; EPA 2007; FDA 2006, 2008). Rare sono le analisi effettuate su colture cellulari pi๠sensibili quali le cellule germinali o sullo sviluppo embrionale nei mammiferi. Finora studi preliminari evidenziavano effetti tossici di diverse NPs su cellule staminali spermatogoniali (Braydich-Stolle et al., 2010) e su spermatozoi (Guo, et al., 2009) di topo in maniera dose e taglia-dipendente (Taylor, 2012); sullo sviluppo follicolare nel topo (Xu, 2012), ed infine su embrioni di zebrafish (Bai et al., 2010 a,b) e di topo (Fynewever et al., 2007). Tuttavia ulteriori indagini sono necessarie al fine di analizzare gli effetti citotossici delle diverse NPs sulle cellule germinali e sullo sviluppo embrionale. Negli ultimi anni, studi mostravano l'estrema sensibilità  dello sviluppo embrionale preimpianto verso diversi fattori ambientali e l'effetto di questi ultimi sia in vivo (es. alimentazione materna) che in vitro (es. coltura embrionale) sulla salute a lungo termine dei nati (Fleming et al., 2004; Sinclair and Singh, 2007; Thompson et al., 2007; Watkins et al., 2008a). Recenti lavori, infatti, evidenziavano che il programma intrinseco dell'embrione sembra rispondere a fattori estrinsechi all'ambiente materno regolando lo sviluppo embrionale mediante meccanismi cellulari, fisiologici ed epigenetici. Queste risposte all'ambiente potrebbero influenzare lo sviluppo e il comportamento sia delle sviluppo precoce che di quello tardivo e postnatale. Alla luce di questi dati, il secondo obiettivo di tale lavoro di tesi era quello di analizzare gli eventuali effetti tossici di differenti NPs a diverse concentrazioni su sistemi biologici estremamente sensibili, quali la coltura di cellule germinali e lo sviluppo embrionale bovino in vitro (Fleming et al., 2004; Sinclair and Singh, 2007; Thompson et al., 2007; Watkins et al., 2008a). In particolare venivano analizzati gli effetti citotossici sia sulla cinetica spermatica che sullo sviluppo embrionale bovino in vitro in termini di percentuali di segmentazione, di sviluppo fino allo stadio di 8 cellule e di blastocisti. Inoltre veniva studiata la qualità  delle blastocisti in termini di numero medio di cellule e di percentuale di nuclei con DNA frammentato.