Studio di Mutazioni Geniche e Variazioni Copy-Number implicate nel deficit combinato degli Ormoni Ipofisari(CPHD)

La crescita normale di un individuo ਠil risultato dell'azione coordinata di molteplici ormoni e recettori codificati da geni e a tal proposito, discreto interesse ਠstato dato ai geni tipici dell'asse del GH. Tuttavia altri geni, pi๠a monte di questi e responsabili dello sviluppo dell'ipofisi contribuiscono alla crescita normale o patologica. Alcuni geni studiati sono POU1F1, PROP1, LHX3, LHX4, HESX1, SOX3 e svariate loro mutazioni sono state identificate come causa di panipopituarismo (CPHD=Combined Pituitary Hormone Deficiency). In realtà  la ricerca genetica non spiega ancora molte anomalie ipofisarie e molte mutazioni devono ancora essere identificate. Uno degli scopi del dottorato, svoltosi nel laboratorio di Genetica molecolare di Pediatria, ਠstata l'identificazione di mutazioni geniche da un gruppo di pazienti CPHD considerando in particolare i geni POU1F1, LHX3, SOX3, non ancora messi a punto presso il laboratorio. L'approccio sperimentale si ਠbasato sulle seguenti fasi: prelievo delle informazioni di sequenza da GeneBank, progettazione di primers per amplificare le porzioni esoniche, messa a punto delle fasi della PCR e del sequenziamento, analisi della sequenza e confronto con le informazioni di sequenza depositate allo scopo di rintracciare eventuali mutazioni o varianti. La bassa percentuale di mutazioni in questi geni non ha permesso finora di rintracciare mutazioni nelle porzioni esoniche salvo che in un soggetto, nell'esone 6 di LHX3b (nuova mutazione, recessiva eterozigote, c.1248A>G implicata nella mutazione p.T377A della sequenza proteica). Un metodo di screening di questa mutazione impiegando l'enzima di restrizione SacII ਠstato usato, senza rilevare nessun altra occorrenza dell'allele mutato in 53 soggetti di controllo. Oltre alla messa a punto del sequenziamento e di alcune tecniche di analisi di singoli SNP o piccoli INDELs per i 3 geni, la ricerca svolta ਠstata orientata all'impiego di metodi di rilevamento di riarrangiamenti genetici comportanti ampie delezioni e/o variazioni del copy-number di esoni/interi geni detto MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) e progettato da MRC-Holland. Il sequenziamento infatti non permette di rilevare tali alterazioni quando sono ampie ed in eterozigosi. Per esempio, in un'ampia delezione in eterozigosi, l'intervallo delimitato dai primers usati per la PCR puಠnon includere totalmente la porzione interessata da delezione su un cromosoma cosicchà© la PCR ed il sequnziamento si basano solo sulle informazioni dell'altro cromosoma non deleto. Un vantaggio della tecnica MLPA, ਠl'analisi contemporanea di una quarantina di siti posti su svariati geni. Questa metodo tuttavia puಠessere affetto da un certo margine di errore spesso dipendente dalla qualità  del DNA e dovrebbe essere affiancato e validato da altre tecniche pi๠impegnativa dal punto di vista sperimentale ma pi๠solide, per esempio la Real Time PCR detta anche PCR quantitativa (qPCR). In laboratorio, grazie all'MLPA si ਠverificata la condizione di delezione eterozigote di un paziente “storico” per il gene GH1 e la stessa mutazione ਠstata rilevata anche con la qPCR usando lo strumento Corbett Rotor Gene 6000 (Explera). Invece un'analisi solo con la qPCR di variazioni del copy-number (CNV) per SOX3 in pazienti maschili non ha ancora evidenziato anomalie. Entrambe le tecniche hanno aspetti interessanti, il miglior approccio al momento sembra un'analisi iniziale di pazienti con l'MLPA, seguita dalla verifica di un eventuale esito anomalo impiegando la real-time PCR.