Alterazioni specifiche del trascrittoma dei microrna e struttura globale del network in carcinoma colorettale dopo trattamento con Cetuximab

Il carcinoma del colon-retto (CRC) e' una delle neoplasie piu' frequenti nel mondo occidentale e rappresenta un problema socio-sanitario di notevole rilievo. E' noto che non tutti i pazienti affetti da CRC rispondono in modo positivo alla terapia con i piu' comuni agenti antitumorali (es. Cetuximab): vi sono infatti dei fattori genetici predittivi della risposta, tra i quali sicuramente uno dei piu' noti e' lo stato mutazionale di KRAS. Tuttavia, questo approccio diagnostico molecolare e' comunque invasivo, poiche' presuppone un prelievo bioptico. Per questa ragione, diversi gruppi di ricercatori stanno cercando di individuare biomarcatori che, oltre ad essere specifici, siano identificabili con procedure non invasive. Indubbiamente, tra i possibili marcatori, i microRNA (miRNA) rivestono un ruolo particolarmente rilevante. I miRNA sono piccole molecole di RNA non codificante che svolgono un ruolo critico nella regolazione dell ' espressione genica in tutti i processi cellulari. Ad oggi, sono stati pubblicati diversi dati che suggeriscono come il profilo di espressione dei miRNA vari in modo specifico nei diversi tipi di cellule neoplastiche, in correlazione con il fenotipo del tumore e con la sua evoluzione. L' oggetto di questa tesi e' stato lo studio della relazione tra risposta terapeutica e modifiche del trascrittoma dei miRNA nel tumore colorettale (CRC), che ad oggi rimane sconosciuta. Per raggiungere questo obiettivo abbiamo effettuato il profiling dell'espressione di 667 miRNA in due linee cellulari umane CRC, una sensibile e l'altra resistente al Cetuximab (Caco-2 e HCT-116, rispettivamente) mediante RT-PCR con sonde TaqMan. Le Caco-2 e le HCT-116 esprimono diversi set di miRNA dopo il trattamento: in particolare, mentre nelle Caco-2 sono differenzialmente espressi 21 miRNA (DE miRNA), nelle HCT-116 i DE miRNA sono 22 (t-test, p <0.01). Testando l'espressione dei DE miRNA in campioni paraffinati di pazienti affetti da CRC, abbiamo scoperto che il miR-146b-3p e il miR-486-5p sono piu' abbondanti nei campioni con il gene KRAS mutato rispetto a quelli wild-type (test di Wilcoxon, p <0.05). Dall' analisi dei cluster e delle famiglie geniche dei DE miRNA e' emerso che miRNA localizzati in stretta prossimita' genomica o appartenenti alla stessa famiglia mantengono spesso lo stesso trend di espressione in seguito al trattamento. Secondo dati di letteratura, il 67% dei DE miRNA e' coinvolto nel cancro, incluso il CRC, mentre 19 targets dei DE miRNA sono stati precedentemente associati alla pathway del Cetuximab e del CRC, come ad esempio KRAS (targets dei DE miRNA let-7b e let-7e), PTEN e PIK3R1 (entrambi targets del miR-486-5p). Abbiamo identificato 25 fattori di trascrizione che putativamente controllerebbero questi DE miRNA; 11 di questi sono gia' stati individuati per essere coinvolti nella patogenesi del CRC, come ad esempio MYC, che controlla positivamente l ' espressione del miR-17* (un marcatore del CRC i cui livelli sono abbondanti in biopsie e plasma di pazienti). Sulla base di questi dati, suggeriamo che la sottoespressione di let-7b e let-7e e la sovraespressione del miR-17* potrebbero far considerare questi miRNA come marcatori molecolari candidati per la resistenza al Cetuximab. L'analisi funzionale globale delle network dei targets dei DE miRNA ha mostrato una significativa sovra-rappresentazione di processi biologici correlati al cancro, all' angiogenesi e alla risposta immunitaria, e di moduli centrati sui nodi critici coinvolti nell' internalizzazione di EGFR e sua degradazione ubiquitina-mediata. L'identificazione di miRNA la cui espressione e' legata all' efficacia della terapia, dovrebbe quindi consentire di predire la risposta dei pazienti al trattamento e potrebbe condurre ad una migliore comprensione dei meccanismi molecolari della risposta farmacologica. Il lavoro esposto in questa tesi e' stato pubblicato nel 2010 su Molecular Cancer Therapeutics (E-pub 29 Settembre).