Biologic al role of Pseudomonas lipodepsipeptides

Il piano sperimentale ha previsto la crescita di alcuni ceppi di Pseudomonas produttori di differenti Lipodepsipeptidi (LDP). àƒ stata valutata la produzione di nuovi lipodepsipeptidi, ne àƒ¨ stata caratterizzata la struttura mediante NMR e lࢠattivitàƒ biologica. Due nuovi LDPs sono stati identificati: la Cormicina (CM) un lipodepsinonapeptide prodotto da Pseudomonas corrugata e SP508, una siringopeptina da 22 aminoacidi prodotta da P. syringae pv. lachrymans strain 508. Di entrambe ne àƒ¨ stata caratterizzata lࢠattivitàƒ biologica contro batteri e funghi patogeni per lࢠuomo e per le piante. Le tossine di Pseudomonas prodotte sono state liofilizzate e utilizzate in saggi in vitro contro spore di funghi potenzialmente patogeni per le piante (mele) sia in campo che in post raccolta. Sono stati individuati alcuni patogeni e sistemi modello, di piàƒ¹ facile preparazione e conservazione, che permettano una rapida e significativa valutazione dellࢠefficacia antimicrobica dei metaboliti purificati. I sistemi modello derivano essenzialmente dalla membrana plasmatica di patogeni importanti per alcune delle colture di interesse locale, come le mele. I funghi utilizzati sono Botrytis cinerea, Alternaria alternata, Penicilim digitatum e Fusarium oxisporum. Inoltre si àƒ¨ proposto di chiarire il meccanismo dࢠazione dei lipodepsipeptidi, metaboliti secondari di Pseudomonas syringae e Pseudomonas. corrugata, mediante lࢠutilizzo di vari ceppi di Saccharomyces cerevisiae (S.C.) geneticamente modificati negli sfingolipidi e negli steroli di membrana. I saggi effettuati mostrano che i diversi LDP hanno un meccanismo di azione simile (Pore Forming Toxins) ma mostrano una differente interazione con la membrana, in particolare i metaboliti prodotti da P.corrugata a differenza di quelli prodotti da P.syringae sono maggiormente attivi su ceppi di SC senza steroli di membrana. Inoltre la CM e la CP sembrano non interagire con lࢠOH in posizione ? sulla catena lipidica dello sfingolipide, mentre lo stesso OH risulta indispensabile per lࢠattivitàƒ della SRE e SP22, anche lࢠOH legato al C-4 risulta indispensabile per lࢠattivitàƒ di SRE, CM e SP22. Solo la SP22 àƒ¨ attiva anche quando àƒ¨ assente lࢠinositolo sullࢠantenna glicidica dello sfingolipide (con la carica negativa portata dal fosfato). Sono stati altresàƒ¬ effettuati esperimenti di biocontrollo su mele utilizzando diversi ceppi di Pseudomonas spp. Evidenziando che alcuni ceppi, pur non produttori di LDP, hanno avuto effetti antagonistici superiori ai ceppi produttori di LDPs nei confronti di alcuni funghi patogeni delle mele. Si presuppone pertanto che lࢠattivitàƒ antifungina di questi batteri sia dovuta alla loro maggiore produzione di enzimi chitinolitici. àƒ stata pertanto analizzata la capacitàƒ di produrre enzimi da parte dei ceppi di Pseudomonas testati, àƒ¨ stata testata la produzione di endo ed eso chitinosi. I saggi di biocontrollo mostrano che isolati di P.syringae 1480A e 46P riducono i sintomi nella post-raccolta quando una sospensione batterica e conidi di patogeno sono stati inoculati a diverse concentrazioni. Questi batteri hanno anche un eccellente risultato nel limitare la formazione di marciumi immergendo le mele nella sospensione batterica. Sono state avanzate delle preoccupazioni nella commercializzazione di preparati a base di Pseudomonas a causa dellࢠattivitàƒ emolitica dei suoi metaboliti a concentrazioni superiori a 1 ?M, ma non sono ancora noti dati sulla possibile interazione uomo-lipodepsipeptidi. Inoltre, non àƒ¨ ancora del tutto chiaro se questi metaboliti possano essere assorbiti dalle cellule dellࢠuomo o essere degradati dagli enzimi proteolitici dellࢠapparato digerente. D'altronde la letalitàƒ per gli eritrociti, test normalmente impiegato per valutare la patogenicitàƒ per lࢠuomo, non implica necessariamente che un composto non possa essere usato come antibiotico: lࢠattivitàƒ emolitica si puàƒ² presentare infatti a concentrazioni molto maggiori di quelle necessarie per avere unࢠattivitàƒ contro i patogeni fungali. In questࢠottica sono stati effettuati saggi in vitro simulando una digestione umana di LDP (SRE). Lࢠesperimento àƒ¨ stato condotto mediante lࢠutilizzo in varie concentrazioni di enzimi del tratto gastroenterico coinvolti nella digestione proteica: pepsina per lo stomaco, tripsina e ? chimotripsina per il tratto intestinale e pronase. Si àƒ¨ notato un sensibile decremento dellࢠattivitàƒ emolitica della tossina nelle diverse fasi della digestione, specialmente durante la fase intestinale ad opera di tripsina e ? chimotripsina, contemporaneamente ad un decremento della concentrazione di SRE calcolata mediante HPLC.