Caratterizzazione biochimica e funzionale del gene pvf-1, membro della famiglia PDGF/VEGF, in Caenorhabditis elegans

PVF-1 (PDGF/VEGF Factor-1) àƒ¨ un membro della famiglia PDGF/VEGF in C.elegans. I membri di tale famiglia presentano il motivo ࢠPDGF likeࢠ, contenente otto residui di cisteina con una caratteristica spaziatura, importante per la formazione di dimeri attivi. Questi ultimi sono fattori angiogenici: inducono angiogenesi in vivo, proliferazione e migrazione di cellule endoteliali in vitro. Lࢠazione àƒ¨ mediata da recettori ad attivitàƒ tirosin-chinasica e da recettori chiamati Neuropiline, identificate la prima volta nelle cellule nervose e poi ritrovate anche nelle cellule endoteliali. Questa scoperta àƒ¨ stata la prima evidenza di un coinvolgimento nello sviluppo del sistema vascolare di proteine importanti nello sviluppo del sistema nervoso, in particolare nella guida degli assoni. Recentemente àƒ¨ stato dimostrato che i membri della famiglia delle Semaforine mediante lࢠinterazione con la famiglia di recettori delle Plessine e delle Neuropiline, sono in grado di regolare la migrazione non solo degli assoni ma anche delle cellule endoteliali. Lo scopo della tesi àƒ¨ caratterizzare biochimicamente e funzionalmente PVF-1 in C.elegans per chiarire i meccanismi molecolari che regolano la funzione dei geni della famiglia PDGF/VEGF coinvolti non solo nello sviluppo del sistema vascolare, ma anche del sistema nervoso ed identificare nuovi geni che possono interagire nello stesso ࢠpathwayࢠ. Nella prima parte del lavoro di tesi àƒ¨ stato dimostrato che PVF-1, prodotta in cellule di mammifero, àƒ¨ una proteina N-glicosilata secreta dalle cellule come dimero. Tale proteina àƒ¨ in grado di legare i recettori umani VEGFR-1 e VEGFR-2 e di indurre la fosforilazione dei residui di tirosina che attivano a loro volta la cascata di trasduzione intracellulare del segnale. Inoltre i risultati ottenuti da due tipi di saggi, l ࢠCapillary-like tube formationࢠin vitro e ࢠChorioallantoic Membrane Assayࢠ(CAM) in vivo dimostrano che PVF-1 induce angiogenesi proprio come gli altri membri della famiglia PDGF/VEGF. PVF-1 quindi àƒ¨ lࢠunico membro della famiglia PDGF/VEGF in C.elegans che conserva le caratteristiche biochimiche e le attivitàƒ biologiche dei fattori di crescita PDGF/VEGF. Nella seconda parte del lavoro di tesi si analizza lࢠespressione e la funzione di pvf-1 in C.elegans con tecniche di biologia molecolare ed approcci di genetica classica avendo isolato un putativo mutante nullo del gene. Linee di vermi transgenici esprimono in tutte le cellule muscolari striate durante il secondo ed il terzo stadio larvale di sviluppo un gene marcatore la cui espressione àƒ¨ regolata dalla putativa regione regolativa di pvf-1. Questo dato di espressione spazio-temporale di pvf-1 àƒ¨ stato confermato anche da esperimenti di immunofluorescenza usando un anticorpo policlonale prodotto in coniglio che riconosce PVF-1. In collaborazione con il gruppo di ricerca canadese del Prof. Culotti, àƒ¨ stato isolato da una libreria di mutanti di delezione per PCR con oligo specifici per il gene dࢠinteresse, un putativo mutante nullo di pvf-1, chiamato pvf-1(ev763). Lࢠanalisi preliminare dei vermi pvf-1(ev763) evidenzia la mancanza di un ruolo cruciale del fattore sia durante lo sviluppo embrionale e larvale che nella vita adulta. Infatti i vermi omozigoti nulli sono vitali, fertili e non presentano alterazioni morfologiche evidenti. Inoltre considerando che il gene àƒ¨ espresso nelle cellule muscolari striate, si àƒ¨ analizzata la capacitàƒ di movimento del mutante rispetto al ceppo selvatico N2. Dallࢠosservazione di questi vermi risulta che il modo di muoversi dei due ceppi non mostra differenze. Il fatto che pvf-1, come àƒ¨ stato dimostrato nella prima parte del lavoro di tesi, àƒ¨ in grado di indurre angiogenesi in vivo ed in vitro ed àƒ¨ espresso in una precisa finestra temporale di sviluppo del verme in C.elegans suggerisce un suo possibile coinvolgimento in processi di migrazione cellulare che avvengono proprio durante lo stadio larvale L2 e L3. Allo scopo di osservare la migrazione di specifiche cellule nel ceppo mutante del gene dࢠinteresse, pvf-1(ev763) àƒ¨ stato incrociato con ceppi di vermi che mostrano alcune classi di motoneuroni, neuroni sensoriali e due cellule somatiche della gonade, chiamate DTC, marcate con proteine fluorescenti. Lࢠosservazione, mediante microscopio ad alta risoluzione ed a fluorescenza, di questi vermi rivela che pvf-1 non àƒ¨ coinvolto nei processi di migrazione di queste specifiche cellule. La ricerca di un fenotipo dei vermi omozigoti nulli per pvf-1 àƒ¨ proseguita incrociando il ceppo pvf-1(ev763) questa volta con mutanti di geni la cui funzione àƒ¨ giàƒ nota al fine non solo di capire in quale processo biologico àƒ¨ coinvolto pvf-1, ma anche di scoprire gli altri geni con cui puàƒ² interagire. In C.elegans sono stati identificati geni omologhi alle famiglie delle Semaforine e delle Plessine dei vertebrati e per alcuni di essi sono stati anche isolati e caratterizzati i mutanti. In particolare il gene plx-1 che codifica il recettore Plessina-A àƒ¨ coinvolto nel processo di migrazione delle cellule di tipo neuronale che costituiscono il primo raggio della coda del maschio. pvf-1(ev763) àƒ¨ stato incrociato con due alleli mutanti di plx-1, chiamati plx-1(nc37) e plx-1(ev724). Lࢠanalisi dei doppi mutanti rivela che lࢠassenza di PVF-1 determina un aumento di penetranza del fenotipo del primo raggio della coda del maschio rispetto ai singoli mutanti di plx-1. Recentemente àƒ¨ stato anche dimostrato che il gene unc-73 e mig-2, codificanti rispettivamente una proteina coinvolta nellࢠattivazione dei geni RAC-GTPase, ed una RAC-GTPasica, sono richiesti per la corretta migrazione del primo raggio. I doppi mutanti ottenuti dallࢠincrocio di pvf-1(ev763) con i mutanti di unc-73 e mig-2 mostrano anchࢠessi un aumento del fenotipo rispetto ai singoli mutanti. Ciàƒ² conferma che PVF-1 àƒ¨ coinvolto nel processo di migrazione del primo raggio della coda del maschio ed agisce mediante una proteina RAC-GTPasi. In seguito si àƒ¨ cercato di scoprire il recettore con cui PVF-1 interagisce per attivare questo meccanismo molecolare. In C.elegans sono stati indetificati, per omologia di sequenza ai VEGFRs dei vertebrati, quattro recettori tirosin-chinasici, chiamati ver-1,ver-2,ver-3 e ver-4. In particolare sono stati isolati i mutanti di ver-3 e ver-4 che sono vitali e non mostrano, come pvf-1(ev763), alcuna alterazione morfologica evidente. I risultati dei doppi mutanti, ottenuti dallࢠincrocio di ciascun mutante dei recettori con plx-1 rivelano che solo il gene ver-4 si comporta come pvf-1 la cui assenza determina lࢠaumento del difetto di migrazione del primo raggio, mentre lࢠassenza di ver-3 sembra sopprimere tale fenotipo. Ciàƒ² suggerisce che PVF-1 potrebbe essere il ligando di VER-4. Questa ipotesi àƒ¨ stata successivamente smentita dai risultati ottenuti dal triplo mutante dei geni plx-1, ver-4 e pvf-1. Questࢠultimo infatti non mostra una penetranza del fenotipo uguale a quella del doppio mutante di plx-1 e ver-4 ma maggiore dimostrando che il recettore VER-4 agisce in questo processo con un meccanismo molecolare diverso da quello di PVF-1. Si puàƒ² concludere che il processo che determina la migrazione delle cellule che costituiscono il primo raggio della coda del maschio àƒ¨ regolato da piàƒ¹ meccanismi molecolari. Quello costituito dal ligando SMP-1 ed il recettore PLX-1 àƒ¨ il principale, come àƒ¨ dimostrato dal fatto che i singoli mutanti di questi geni mostrano il difetto di migrazione del primo raggio della coda del maschio, al contrario dei singoli mutanti di pvf-1 e ver-4 che non hanno questo fenotipo. Infine un altro dato interessante emerso in questo lavoro di tesi àƒ¨ che i meccanismi molecolari di SMP-1 e di PVF-1 utilizzano entrambi per la trasduzione del segnale i geni RAC-GTPasi che sono coinvolti in diversi processi di migrazione e crescita degli assoni.