Pathways metabolici multipli per la degradazione di composti aromatici: uno studio di upper e lower pathways in Pseudomonas stutzeri OX1

Pseudomonas stutzeri OXI utilizza come unica fonte di carbonio e di energia l'oxilene, il toluene, i cresoli ed alcuni dimetilfenoli (DMP). Pertanto il microorganismo potrebbe essere efficacemente utilizzato per interventi di biorisanamento di aree inquinate da composti di natura aromatica. Lo stadio iniziale dell'ossidazione di molecole aromatiche ਠoperato dalla Toluene/o-xilene Monoossigenasi (ToMO), e dalla Fenolo ossidrilasi (PH), che costituiscono l'upper pathway della via degradativa. Le molecole prodotte sono poi convertite dagli enzimi del lower pathway in intermedi del ciclo di Krebs. Sia ToMO che PH agiscono su un range simile di substrati e pertanto la loro funzione appare ridondante. I primi enzimi del lower pathway del batterio sono la catecolo 2,3 diossigenasi (C2,3O), enzima responsabile del taglio idrolitico dell'anello aromatico, la semialdeide 2 idrossimuconica deidrogenasi (HMSD) e la semialdeide 2-idrossimuconica idrolasi (HMSH). E' ancora da ricordare che in P.stutzeri OX1 ਠpresente un differente upper pathway, il TOL upper pathway, responsabile dei primi passaggi di ossidazione di composti quali il m- ed il p-xilene. Il primo enzima di tale pathway ਠla xilene monoossigenasi (XMO). La contemporanea espressione di XMO e di ToMO sembra tuttavia essere letale per il microrganismo. L'obiettivo principale del presente progetto di tesi di dottorato ਠstata la comprensione delle proprietà  di alcuni enzimi dei pathway catabolici di P. stutzeri OX1. Tale progetto si ਠarticolato in diversi punti. In primo luogo ਠstato condotto uno studio cinetico degli enzimi ToMO e PH per comprendere le ragioni metaboliche della loro apparente ridondanza di funzioni. L'analisi dei parametri cinetici ha evidenziato che ToMO ਠpi๠efficiente nel primo passaggio di ossidrilazione, mentre PH ਠpi๠efficiente nel secondo. Inoltre i due enzimi mostrano una regioselettività  diversa in entrambi gli stadi di ossidrilazione. I dati raccolti portano alla conclusione che le attività  degli enzimi ToMO e PH non sono ridondanti ma complementari. L'efficienza catalitica dei due enzimi e le loro proprietà  di regioselettività  sembrano aver consentito l'ampliamento delle capacità  metaboliche di Pseudomonas stutzeri OX1. Inoltre, sulla base dei risultati della caratterizzazione cinetica sono stati realizzati e caratterizzati mutanti dell'enzima ToMO con alterata regioselettività . In particolare ਠstato osservato che l'accoppiamento del mutante ToMO-E103G con l'enzima PH incrementa l'efficienza dell'upper pathway portando alla formazione preferenziale di prodotti che possono entrare nel lower pathway. In questo lavoro di tesi ਠinoltre riportato uno studio preliminare del primo enzima dell'upper TOL pathway, XMO, per investigare se alla base della letalità  associata alla contemporanea espressione dei due pathway (TOU e TOL) vi fosse qualche fenomeno di interferenza tra i due enzimi che iniziano le vie metaboliche, ToMO e XMO.I dati indicano che la contemporanea azione dei due enzimi porta a una perdita di efficienza metabolica, ma non permettono di avere indicazioni sulla eventuale dannosità  dovuta all'accumulo di intermedi non ulteriormente metabolizzabili. I dati presentati nella terza parte della tesi sono relativi allo studio di due enzimi del lower pathway, HMSD e HMSH, ed al loro utilizzo nella conversione dei prodotti generati da forme mutate dell'enzima C2,3O. I dati indicano che i primi enzimi del pathway, nel nostro caso ToMO e PH, presentano bassa specificità  di substrato e quindi tendono ad ossidrilare un gran numero di composti aromatici. Al contrario gli enzimi successivi, come HMSD e HMSH, divengono progressivamente pi๠specifici consentendo l'introduzione di poche molecole in pathway metabolici centrali. Alterare la specificità  di substrato di un enzima localizzato in punti chiave del pathway (come ਠla C2,3O) implica che le caratteristiche degli enzimi che seguono devono necessariamente accordarsi con le nuove proprietà  cataboliche acquisite.