Production and evolution of peptides naturally derived from milk protein hydrolysis or generated by technological processes: proteomic and bio-functional characterization

L'obiettivo della tesi di Dottorato ਠstato quello di sviluppare una strategia analitica che, mediante l'applicazione di procedure di tipo proteomico/peptidomico, consentisse di valutare la presenza, l'evoluzione e la bioattività  dei peptidi generati sia per effetto proteolitico indotto dal processo tecnologico che per quello dovuto alle proteasi endogene al latte. Per questo motivo, il lavoro di tesi si articola in due capitoli, ciascuno per le rispettive tematiche sopra menzionate: I. studio dell'evoluzione dei pattern peptidici prodotti durante il processo tecnologico di produzione della Mozzarella di Bufala Campana DOP nei sieri di caseificazione a partire dal latte di bufala. II. studio dei profili peptidici in campioni individuali di latte di asina. Per quanto riguarda il primo capitolo di questa tesi di Dottorato, ਠstato sviluppato un approccio integrato di tipo proteomico e bio-funzionale al fine di: 1) delineare mediante approccio proteomico il pathway di formazione dei peptidi a potenziale attività  biologica lungo l'intera filiera di lavorazione della Mozzarella, seguendone la produzione a partire dal latte di bufala e passando per il siero dolce, per il siero acido fino ad arrivare alla scotta. 2) studiare l'effetto di modulazione delle componenti peptidiche estratte sulle cellule CaCo2 in termini di attività  antiproliferativa preliminarmente e, successivamente, di ulteriore approfondimento del biochimismo coinvolto nella risposta cellulare per le frazioni risultate pi๠attive. Nel secondo capitolo della tesi di Dottorato, invece, la strategia di tipo proteomico ਠstata applicata a 18 campioni di latte di asina individuali forniti nell'ambito del progetto SELMOL. L'approccio peptidomico mediante spettrometria di massa MALDI-TOF-MS, ha permesso di caratterizzare la componente peptidica in ciascun latte di asina individuale e di identificare, in funzione dei cluster peptidici generati, gruppi omogenei di campioni tra loro simili; negli stessi campioni ਠstata valutata l'attività  antiossidante in modo da determinare il ruolo dei peptidi del latte d'asina nel prevenire le reazioni di perossidazione lipidica. Dalla valutazione complessiva dei pattern peptidici delineati, ਠemerso che l'attività  delle proteasi endogene al latte di asina si esplica con una specificità  di azione intrinseca se comparata a quella studiata per il latte di bufala. L'attività  antiossidante, ਠstata valutata mediante TBARS-test incubando le componente peptidiche estratte da ciascun campione di latte in presenza di acido linolenico e perossido di idrogeno al fine di ricreare condizioni di forte stress ossidativo quali sono quelle cui normalmente ਠesposto l'organismo anche con la normale respirazione cellulare. I risultati ottenuti permettono di constatare che gran parte dei campioni determinano un effetto di diminuzione del contenuto di TBARS, particolarmente accentuato in alcuni casi. Dalla comparazione effetto-caratteristiche strutturali, ਠipotizzabile che l'effetto antiossidante riscontrato, sia ascrivibile ad una azione sinergica di due classi di peptidi a potenziale bioattività  antiossidante: i caseinfosfopeptidi provenienti dall'?s2-CN e quelli generati dalla porzione C-terminale della ?-CN. Preliminarmente alla caratterizzazione dei profili peptidici di ciascun campione di latte di asina, ਠstata condotta una caratterizzazione della componente caseinica, mediante uno studio combinato dei profili ottenuti da separazione elettroforetica 1-DE (PAGE, UTLIEF) e 2-DE (PAGE ? UTLIEF) ottenuti grazie a colorazione con Comassie Brilliant Blue ed anticorpi policlonali, con l'analisi strutturale mediante spettrometria di massa. L'applicazione combinata di queste metodologie, ci hanno consentito di identificare contemporaneamente l'?s1-CN, ?s2-CN, ?-CN e k-CN con le relative eterogeneità  dovute a fosforilazione (?s1-CN, ?s2-CN, ?-CN), glicosilazione (k-CN) e ad un incorretto splicing dell'RNA in m-RNA (forme delete di ?s1-CN e ?-CN). Inoltre sono state individuate 11 diverse componenti diversamente glicosilate per la k-CN, 6 forme fosforilate per la ?-CN e l'?s1-CN, 3 isoforme diversamente fosforilate per l'?s2-CN ciascuna con 11, 12 e 13 gruppi fosfato. Relativamente all'?s2-CN, per la prima volta ਠstata definita la sequenza primaria di questa proteina a partire dalla sequenza dedotta dal cDNA noto in letteratura. Inoltre, la ?-CN ਠstata identificata sia nello stato omozigote che eterozigote per la presenza di una variante genetica con MW di 28 unità  di massa in pi๠rispetto al pi๠comune fenotipo di ?-CN.