Ruolo della proteina DDB-1 (DNA damage-binding protein-1) nella proteolisi di p27Kip1 indotta da radiazioni ultraviolette

DDB1 (DNA damage-binding protein) ਠstata originariamente identificata, in cellule di mammifero, come la subunità  maggiore (p127) di un complesso eterodimerico che lega il DNA danneggiato da radiazioni ultraviolette (UV), noto in letteratura come UV-DDB (Ultraviolet- DNA-Damage Binding protein). La localizzazione subcellulare di DDB1 ਠprincipalmente citoplasmatica, ma in seguito ad irradiazione con UV trasloca nel nucleo, dove diviene partner molecolare di proteine coinvolte nel Riparo per Escissione Nucleotidica (NER), contribuendo sia al TCR (riparo accoppiato alla trascrizione) che al GGR (riparo genomico globale). La funzione di DDB1 non à¨, tuttavia, limitata ad assemblare i sistemi di riparo, poich੠ਠstato dimostrato che interagisce anche con diversi fattori trascrizionali e che puಠfunzionare da regolatore trascrizionale. Nel laboratorio dove ho svolto la tesi di dottorato, infatti, abbiamo dimostrato che interagisce con il promotore della fibromodulina (Fmod), una proteina della matrice extracellulare coinvolta nell'assemblaggio delle fibrille di collagene, i cui livelli di espressione aumentano in seguito ad esposizione a UVC. Il coinvolgimento di DDB1 nella regolazione trascrizionale della Fmod ਠstato confermato da esperimenti che dimostrano che la trascrizione di questo gene diminuisce con l'utilizzo di un dsRNA interferente per DDB1 (siDDB1) e aumenta in seguito all'iperespressione del suo cDNA [Bevilacqua et al., 2005]. In un recente lavoro [Iovine et al., 2009] abbiamo, inoltre, dimostrato che anche l'esposizione a radiazioni UVA ed UVB attiva la trascrizione di Fmod, sebbene con modalità  differenti. In particolare, l'incremento dei livelli di espressione della Fmod indotto dagli UVA ਠsignificativamente infuenzato dalla produzione dei ROS, mentre l'incremento indotto dagli UVB ਠstrettamente correlato alla traslocazione di DDB1 dal citoplasma al nucleo. Questi risultati fanno ipotizzare che DDB1 abbia un ruolo cruciale nella regolazione trascrizionale di geni UV-indotti e che esista una correlazione tra la regolazione di questi geni ed il meccanismo di riparo del DNA danneggiato dagli UV. Negli ultimi anni diversi studi hanno portato all'identificazione di un ulteriore ruolo di DDB1 quale proteina adattatrice nei complessi cullina-RING ubiquitina ligasi (CRL) coinvolti nella degradazione di diversi substrati, incluso l'inibitore delle chinasi ciclina dipendente p27Kip1, i cui livelli controllano la progressione del ciclo cellulare. Gli esperimenti descritti in questa tesi hanno lo scopo di valutare il ruolo svolto da DDB1 nella regolazione di p27Kip1, in seguito ad un danno al DNA indotto da UV. L'analisi dell'espressione di p27Kip1 mediante Western Blot di estratti proteici di cellule raccolte a differenti tempi dall'esposizione agli UV, ha messo in evidenza che a basse dosi (5J/m2) di UVC, ma non ad alte dosi, l'espressione nucleare di p27Kip1 si riduce rapidamente. Questa riduzione, che si osserva a circa 6 ore dall'irradiazione, avviene anche in altre linee cellulari (HUH-7, SHSY, Hela, Hek) ed ਠcorrelata alla maggiore espressione di DDB1 nel nucleo. Il trattamento con MG132 ne previene la riduzione UV indotta, dimostrando che questa riduzione ਠin realtà  una degradazione proteasoma-dipendente. Esperimenti di immunoprecipitazione,inoltre, identificano la presenza di DDB1 nel complesso responsabile dell'ubiquitinazione di p27Kip1. Inoltre, esperimenti di RT PCR dimostrano che gli UV non hanno alcun effetto sulla trascrizione del gene p27Kip1, confermando, quindi che la degradazione UV-indotta ਠil risultato di una regolazione di tipo post-traduzionale. I risultati ottenuti forniscono nuove conoscenze sulla regolazione di p27Kip1 nella risposta cellulare ad un danno al DNA indotto dagli UV e supportano l'ipotesi che DDB1 abbia un ruolo chiave in questo meccanismo.