Nuove ipotesi patogenetiche nel pemfigo indotto da farmaci: ruolo dell'acetilcolinesterasi e meccanismi di autofagia

Il pemfigo àƒ¨ una malattia autoimmune potenzialmente letale, che interessa la cute e le mucose, caratterizzata dal distacco delle cellule dellࢠepitelio stratificato (acantolisi). Il pemfigo si sviluppa in seguito ad unࢠinterazione tra fattori endogeni (genetici) ed esogeni. Infatti, in letteratura sono riportati differenti casi di sviluppo o esacerbazione della malattia in pazienti direttamente esposti a pesticidi, o sottoposti al trattamento con farmaci come il captopril o l'enalapril per periodi prolungati, oppure in pazienti che assumono regolarmente alcuni cibi contenenti tannini o vegetali appartenenti alla specie Allium (Raff, 1993; Hetts 1998, Thomberry, 1998; Nicholson, 1999; Gervais, 1999; Ona, 1999; Contassot, 1999). Gli anticorpi circolanti, prodotti nel corso della malattia, sono considerati responsabili della formazione di bolle e di erosioni della pelle e delle mucose. Questo progetto di ricerca àƒ¨ stato suddiviso in due fasi. Nella prima fase àƒ¨ stato valutato lࢠeffetto del captopril sul metabolismo dellࢠacetilcolina, in cheratinociti umani. Lࢠacetilcolina (ACh) àƒ¨ un importante mediatore dellࢠadesione cellulare che interviene sulla crescita, differenziazione, adesione, motilitàƒÂ , formazione della barriera cellulare, secrezione ghiandolare e modulazione della microcircolazione (Kurzen et al., 2007). I cheratinociti umani sintetizzano acetilcolina non neuronale, che agisce a livello locale, regolando alcune funzioni cellulari come proliferazione, adesione cellulare, contatti cellulari mediati dai desmosomi (barriera funzione) e attivitàƒÂ  ghiandolare (Wessler et al., 2003). Il pemfigo àƒ¨ caratterizzato dalla presenza di autoanticorpi diretti contro la desmogleina 1 e la desmogleina 3. Oggigiorno àƒ¨ stato peràƒ² dimostrato che tra i vari autoanticorpi ci sono anche quelli diretti contro le subunitàƒÂ  dei recettori dellࢠacetilcolina ?3 e ?9 e la pemfassina. In particolare, gli autoanticorpi diretti verso i recettori dellࢠacetilcolina sono stati trovati nellࢠ85% dei pazienti con pemfigo volgare e pemfigo foliaceo. A tale proposito, lࢠinteresse del nostro lavoro àƒ¨ stato rivolto alla modulazione dellࢠacetilcolina durante le manifestazioni acantolitiche del pemfigo. In particolare, àƒ¨ stato valutato se il captopril, noto induttore di pemfigo, potesse interferire con il rilascio di Ach, modulando lࢠacetilcolinesterasi (AChE), enzima deputato alla sua degradazione. Mediante RT-PCR e western blot sono stati valutati i livelli di espressione di AChE, in colture primarie di cheratinociti (NHEK) e HaCat trattati con captopril. In seguito, per valutare lࢠeffetto del captopril su AChE, àƒ¨ stato eseguito un saggio enzimatico. Infine, per valutare lࢠeffetto della riduzione di ACh sulla coesione cellulare àƒ¨ stata analizzata lࢠespressione di alcuni geni coinvolti nellࢠacantolisi quali la metalloproteinasi 9 (MMP-9), la desmogleina 3 (DSG3), la caspasi 3 e la caderina E. Nella seconda parte del progetto, sono stati analizzati i pathway di morte cellulare attivati da differenti molecole, noti induttori di pemfigo. Scopo di questa seconda fase àƒ¨ di verificare se nella patogenesi del pemfigo intervengono diversi pathway di morte cellulare oltre a quello accertato di tipo apoptotico. Essendo, il pemfigo una malattia multifattoriale, lࢠattenzione si àƒ¨ focalizzata sul pemfigo indotto da farmaci e da molecole presenti negli alimenti. Colture primarie di cheratinociti (NHEK) e HaCat sono stati trattati con acido tannico, derivato allilico e ampicillina, tutti noti induttori di pemfigo, per valutare mediante RT-PCR i livelli di espressione di beclin-1 e ?-calpain, rispettivamente marcatori di autofagia e necrosi programmata. Inoltre, àƒ¨ stata valutata lࢠespressiome della MMP-9, DSG3, caspasi 3 e caderina E. Gli esperimenti sono stati condotti anche in presenza di inibitori specifici per lࢠapoptosi.