Profilo trascrizionale dei microsporociti del mutante meiotic chromosome condensation di Arabidopsis mediante laser microdissection microarray (LMM)

I meccanismi molecolari che regolano la meiosi nelle piante sono ancora poco noti. Finora sono stati isolati circa cinquanta geni meiotici vegetali soprattutto tramite mutanti inserzionali di Arabidopsis thaliana con approcci di †œforward†� e †œreverse genetics†�, in quest'ultimo caso utilizzando strategie comparative con organismi modello. Studi recenti evidenziano un coinvolgimento delle modificazioni istoniche post-traduzionali, tra cui l'acetilazione, nel processo meiotico di diversi organismi che non includono finora alcuna specie vegetale. La ricerca svolta durante il dottorato ha riguardato l'analisi del trascrittoma nei microsporociti di Arabidopsis thaliana ai fini dell'identificazione dei geni coinvolti nel processo meiotico la cui espressione ਠregolata dall'acetilazione istonica. A tale scopo ਠstata messa a punto in questa tesi la microdissezione laser a cattura (LCM) sui meiociti maschili. Tramite LCM singole cellule identificate al microscopio invertito sono separate dalle sezioni istologiche di tessuti eterogenei facendole aderire ad un film termoplastico tramite l'attivazione di un raggio laser a infrarossi. In questa tesi ਠstata applicata l' LCM combinata con i microarray (LMM) nel mutante meiotic chromosome condensation (mcc) e nel wild type per ottenere il profilo trascrizionale dei microsporociti. Il mutante inserzionale mcc, proveniente da †œenhancer activation tagging†�, isolato presso l'Istituto CNR di Genetica Vegetale di Portici, sovraesprime una putativa acetilasi istonica (GCN5-like N-acetiltransferasi). In tale mutante era stato dimostrato che l'acetilazione istonica ha un ruolo in meiosi ed, in particolare, nella condensazione e segregazione dei cromosomi, oltrechਠnella distribuzione dei chiasmi. E' stata usata la tecnologia LMM per indagare se nel mutante mcc l'aumento di acetilazione degli istoni influenzava anche l'espressione genica e se ciಠavveniva relativamente ad un set di geni durante la meiosi. La tecnica LMM messa a punto in questa tesi sui meiociti include come step principali il criosezionamento, la microdissezione laser a cattura (LCM), l'amplificazione e la biotinilazione dell' RNA e l'analisi microarray (GeneChip Affymetrix, ATH1). Sono stati messi a punto due protocolli di istologia, uno per la criosezione ed uno per l'inclusione in paraffina di bocci fiorali di A. thaliana. Entrambi hanno consentito di conservare l'integrità  del tessuto dell'antera e la morfologia dei meiociti. Poichà© dati di letteratura indicavano che il metodo della criosezione garantiva i migliori risultati in termini di resa dell'RNA, quest'ultimo metodo ਠstato utilizzato negli esperimenti LMM. I microsporociti sono stati prelevati senza essere colorati poichà© le colorazioni potevano compromettere la resa di RNA. Sono stati, infine, definiti i parametri del raggio laser e l'efficienza di cattura per il prelievo dei microsporociti tramite LCM. Sono stati raccolti circa 6000 microsporociti in profase I e successivi stadi meiotici, sia del mutante mcc che del controllo. Da questi ਠstata estratta la quantità  necessaria di RNA da impiegare nell'amplificazione in tre repliche biologiche. àˆ stato utilizzato il protocollo di amplificazione lineare basato sulla tecnologia del promotore del fago T7. Partendo da una quantità  totale di 40 ng di RNA per ogni replica ਠstata ottenuta una quantità  amplificata di almeno 40000 volte, sufficiente per l'analisi microarray. Dai risultati di quest'ultimi, filtrati attraverso una soglia di fold change di 1,5 in scala logaritmica si ਠricavata una lista di 150 geni differenzialmente espressi nel mutante mcc. Sette geni di questa lista particolarmente interessanti per la loro funzione biologica sono stati sottoposti ad analisi quantitativa tramite Real-Time. Sei di questi hanno confermato i dati microarray di espressione genica. I principali risultati del progetto di dottorato hanno evidenziato che: - La tecnica Laser Microdissection Microarray (LMM) ਠvalida per determinare il †œtrascription profiling†� di microsporociti. Tale tecnologia puಠessere estesa anche ad altre specie vegetali di interesse agronomico. - L'aumento dell' acetilazione degli istoni influenza l'espressione genica durante la meiosi. -Centocinquanta geni, di cui il 68% risultava †œup†�, sono differenzialmente espressi nei microsporociti del mutante mcc. Alcune classi di geni quali quelli del ciclo cellulare, dei fattori di trascrizione, della condensazione dei cromosomi, della proteolisi mediata dall' ubiquitina, della ricombinazione meiotica e di trasduzione del segnale sono di particolare interesse biologico. In conclusione, i risultati di questa tesi contribuiscono a formulare nuove ipotesi di lavoro al fine di chiarire la regolazione del processo meiotico in pianta.