Aspetti molecolari, funzionali ed evolutivi dei recettori nucleari nel controllo endocrino della spermatogenesi.

Negli organismi pluricellulari, la capacità  di regolare funzioni vitali come la riproduzione, lo sviluppo e il metabolismo, ha coinciso con l'evoluzione di una delle classi pi๠importanti di fattori di trascrizione, la superfamiglia dei recettori nucleari (NR, Nuclear Receptor) (Bookout et al., 2006). Ad oggi, la superfamiglia dei recettori nucleari nella specie umana ਠcomposta da una cinquantina di geni e pi๠di 75 proteine, in Drosophila melanogaster i recettori nucleari sono circa 21 e ben 270 in Caenorhabditis elegans (Maglich et al., 2001; Robinson-Rechavi et al., 2001; Mangelsdorf et al., 1995). L'elevata conservazione e la distribuzione ubiquitaria lungo il genoma di numerose specie evidenzia l'importanza biologica di tali proteine: non a caso, diversi recettori nucleari sono implicati nella regolazione del ciclo cellulare, nel controllo dei processi apoptotici, nell'infertiltà  e, non ultimo, nel cancro (Clarke et al. 2004; Shulman and Mangelsdorf, 2005). I PPAR sono recettori ormonali nucleari che mediano gli effetti degli acidi grassi e dei loro derivati, intervenendo in numerose funzioni come il metabolismo dei glucidi, dei lipidi, la proliferazione cellulare e il differenziamento (Desvergne and Wahli, 1999). Nell'uomo sono stati identificati tre geni PPAR: il gene PPARA, codificante il recettore hPPAR? (NR1C1), localizzato nella regione 22q12, sul cromosoma 22, il gene PPARB, codificante il recettore hPPAR?/? (NR1C2), localizzato sul cromosoma 6, in posizione 6p21 ed infine il gene PPARG, codificante il recettore hPPAR? (NR1C3) localizzato sul cromosoma 3, nella regione 3p25 (Sher et al., 1993; Issemann et al., 1990; Costa et al., 2010). Il recettore PPAR? ਠquello pi๠intensamente studiato poichà© partecipa a numerosi processi biologici come il differenziamento, lo sviluppo, la riproduzione e il controllo del ciclo cellulare. Inoltre, numerosi dati di letteratura, evidenziano come l'iper-espressione del gene PPARG sia in grado di provocare l'arresto del ciclo cellulare, differenziamento e apoptosi, mentre la sua perdita sia associata all'induzione nello sviluppo del tumore (Grommes et al. 2004; Han and Roman, 2007). L'ormone steroideo 17??estradiolo ਠun regolatore chiave per la crescita, il differenziamento e lo sviluppo sessuale (Hall et al., 2001). L'attività  degli estrogeni ਠmediata da due recettori che appartengono alla famiglia dei recettori nucleari per gli ormoni steroidei (Laudet et al., 1992). Nei vertebrati sono state identificate due isoforme proteiche principali, derivanti da due geni distinti: ESR1 (Estrogen Receptor 1), che codifica l'isoforma ER? (NR3A1) ed ESR2 (Estrogen Receptor 2), che codifica per la proteina ER? (NR3A2) (Gosden et al., 1986; Ponglikitmongkol et al., 1988; Mosselman et al., 1996; Enmark et al., 1997). Gli estrogeni sono importanti fattori di rischio per l'iniziazione di diversi tumori endocrino-correlati (Russo and Russo 1998; Deroo and Korach, 2006). Generalmente, il recettore ER? ਠin grado di promuovere le vie di segnale proliferative e l'entrata nel ciclo cellulare (Hall and McDonnell, 1999), mentre, in presenza del recettore ER?, l'ormone E2 induce la morte cellulare (Acconcia et al., 2005; Marino and Ascenzi, 2008; Acconcia and Marino, 2011). Il gene ESR2 inoltre risulta la forma predominante nel tratto riproduttivo maschile e quella maggiormente espressa nelle cellule germinali primordiali (Saunders et al., 1998; Pelletier et al. 2000; Sharpe 1998; Hess et al, 2001; Hess, 2003). L'uso degli spermatogoni come modello per studiare la proliferazione cellulare diventa sempre pi๠consistente, date le numerose evidenze di un'origine embrionale delle neoplasie testicolari, dovuta alla presenza di gonociti maligni che progrediscono dalla fase di cellule germinali primordiali sino allo stadio di cellule trasformate (Jà¸rgensen et al., 1993; Giwercman et al., 1993; Dohle, 2010). I proto-oncogeni sono attivati ormonalmente durante la spermatogenesi e sono coinvolti negli eventi trascrizionali e nel controllo della proliferazione e differenziazione delle cellule germinali durante specifiche fasi del ciclo dell'epitelio seminifero (Schultz et al., 1995; Iawaoki et al., 1993). Partendo da queste considerazioni e dai dati presenti nella letteratura, il progetto di Dottorato di Ricerca si ਠincentrato sull'analisi del possibile ruolo dei geni PPARG ed ESR2 come fattori pro-apoptotici nella proliferazione cellulare. Nel lavoro di Dottorato ਠstato utilizzato come modello sperimentale il rettile Podarcis sicula, un vertebrato non mammifero a riproduzione stagionale, la cui fisiologia riproduttiva ਠben nota, cosଠcome il profilo annuale degli ormoni sessuali steroidei. La spermatogenesi discontinua del rettile sessualmente maturo Podarcis sicula, si ਠrivelata una fortunata strategia di indagine per l'osservazione della crescita cellulare e di fenomeni difficilmente esaminabili in organismi pi๠complessi come l'uomo, dove gli spermatogoni non proliferano finchਠnon sopraggiunge la pubertà  (Hadziselimovic et al, 1987; Huff et al., 1989, 1991; Dunkel et al., 1997). Nel testicolo di Podarcis sicula, infatti, la massima attività  proliferativa delle cellule germinali avviene solitamente in primavera, si blocca completamente nella fase refrattaria (estate) ed ਠsuccessivamente rallentata in autunno-inverno. Inoltre, in Podarcis sicula, risulta particolarmente interessante poter osservare l'espressione dei geni pro-apoptotici PPARG ed ESR2, nell'organismo immaturo (fase refrattaria) dove, durante le mitosi spermatogoniali, si verifica un progressivo aumento dei livelli degli estrogeni. Questi dati risultano estremamente rilevanti, considerando l'ipotesi della “base fetale delle malattie dell'adulto” che precede l'insorgenza di diverse patologie, come i tumori invasivi del testicolo ed il sistematico ritrovamento dei livelli degli estrogeni stabilmente elevati nelle lesioni neoplastiche testicolari (Skakkebaek 1982). àˆ infatti noto che l'esposizione in utero al momento della differenziazione testicolare ਠun fattore di rischio per lo sviluppo di queste neoplasie e, sperimentalmente, la somministrazione pre-natale e post-natale agli estrogeni provoca regolarmente lo sviluppo di tumori testicolari in alcuni ceppi di roditori (Atanassova et al., 1999; Fielden et al., 2002; Newbold et al., 2000; Bosland, 1996). Al fine di esaminare il ruolo dei geni PPARG ed ESR2 nella spermatogenesi di Podarcis sicula, ਠstato indispensabile conoscere la loro sequenza nel modello animale utilizzato in questo studio. Data la mancanza (o la scarsissima presenza) delle sequenze genomiche relative ai due recettori in Podarcis sicula, il punto di partenza di questo lavoro di tesi à© stato il clonaggio ed il sequenziamento completo di entrambi i geni codificanti i suddetti recettori. L'analisi comparativa delle sequenze nucleotidiche presenti nelle banche dati genomiche per i geni PPARG ed ESR2 in diverse classi di vertebrati ha rivelato un'elevata identità  nucleotidica, in particolare, nonostante la distanza evolutiva dei primati con i rettili, l'allineamento con i rispettivi geni umani ha rivelato una significativa conservazione nucleotidica, pari all'83% per il recettore PPAR? e al 73% per il recettore ER?. Le sequenze nucleotidiche ottenute, sono state depositate nella banca dati NCBI. Il gene PPARG (Provisional Accession No.1481500) si estende per 1383 bp e comprende l'ATG d'inizio traduzione, mentre per il gene ESR2 (Provisional Accession No. 1482266) ਠstato identificato un trascritto di 1522 bp. Dopo aver identificato i geni PPARG ed ESR2, ਠstata analizzata, nel testicolo e nell'encefalo, di Podarcis sicula sessualmente matura, l'espressione relativa durante peculiari fasi del ciclo riproduttivo dell'animale, mediante esperimenti di Real-Time PCR (qRT-PCR).