The role of the Polycomb protein L3MBTL1 in hematopoiesis

Negli ultimi 40 anni, tramite studi di citogenetica sono state identificate diverse alterazioni somatiche ricorrenti nei pazienti con neoplasie ematologiche mieloidi, tra cui le malattie mieloproliferative (MPN), le sindromi mielodisplastiche (MDS) e le leucemie mieloidi acute (AML. Studi genetici e funzionali di queste anomalie hanno consentito di classificarle in un modello definito ࢠtwo hitࢠdella trasformazione delle cellule emopoietiche (leucemogenesi), che comprende: le mutazioni di classe I, che conferiscono un vantaggio proliferativo attraverso l`attivazione di diverse cascate del segnale (tali mutazioni includono quelle di geni che codificano per membri stessi della trasduzione del segnale o attivatori a valle della trascrizione); e mutazioni di classe II, che determinano il differenziamento mieloide delle cellule staminali attraverso la regolazione dell`espressione genica di target trascrizionali specifici della linea mieloide. Piu` recentemente, sono state identificate nuove mutazioni in aggiunta a quelle precedentemente descritte, che pur verificandosi di frequente nei pazienti con malattie ematologiche neoplastiche, non possono essere classificate come di prima o seconda classe. Queste mutazioni, recentemente identificate, sono a carico di geni che codificano per proteine che regolano la metilazione del DNA (DNMT3a, TET2, IDH1/2 ecc) o le modificazioni post-traslazionali degli istoni (L3MBTL1, PRMT5, ASXL1, MLL, EZH2 ecc). E` di grosso interesse scientifico comprendere il ruolo funzionale di queste alterazioni epigenetiche nella patogenesi delle malattie ematologiche, per poter identificare nuovi target (target epigenetici) terapeutici. In questa dissertazione saranno discussi gli studi che abbiamo condotto per elucidare il ruolo di una delle alterazioni somatiche epigenetiche ricorrenti nelle malattie mieloidi (la delezione della proteina Polycomb L3MBTL1). Questi lavori hanno consentito di dimostrare che questi eventi ricorrenti contribuiscono alla leucemogenesi mieloide. Inoltre, abbiamo dimostrato che diverse mutazioni di classe I e II (per esempio JAK2V617F o AML1/ETO) alterano l`epigenoma delle cellule maligne, in aggiunta ai ruoli classici nel promuovere la proliferazione e il differenziamento delle cellule emopoietiche. Questi dati sottolineano l`importanza delle anormalita` epigenetiche nella patofisiologia delle malattie mieloidi. L3MBTL1 rappresenta l`omologo umano del gene oncosoppressore della drosofila, l(3)mbt [lethal(3)malignant brain tumor], la cui inattivazione determina aumentata proliferazione dei neuroblasti ottici della mosca adulta e delle cellule gangliari del cervello della larva. Dopo aver cristallizato i tre domini in tandem (di circa 100 aminoacidi) MBT fu dimostrato che L3MBTL1 umano compatta la cromatina attraverso il legame con residui lisinici mono- e di-metilati sugli istoni H1 (H1K26) e H4 (H4K20) attraverso il secondo dei suoi tre domini MBT. Subito dopo l`identificazione molecolare di l(3)mbt, Bornemann et al. riportarono che un altro gene della Drosphila, Sex comb on midleg (Scm), codificava per una proteina che conteneva due domini MBT in tandem in posizione N-terminale. Scm fu originariamente identificata come un gene richiesto per l`accurato mantenimento della distribuzione dei geni omeotici durante lo sviluppo e fu pertanto classificato come un repressore Polycomb group (PcG). Infatti, gli embrioni mutanti Scm presentano un classico fenotipo PcG di sviluppo in cui i segmenti anteriori del corpo assumono l`identita` di quelli posteriori (per esempio il torace nell`addome), dovuto alla mancanza di repressione dei geni nel locus bithorax. Il gene umano L3MBTL1, e` localizzato sul braccio lungo del cromosoma 20, in posizione 20q12, nell`ambito della regione comunemente deleta nei pazienti con sindromi mielodisplastiche, malattie mieloproliferative o leucemia mieloide acuta, associate alla delezione del cromosoma 20. La delezione del cromosoma 20 (20q-) rappresenta la seconda anormalita` cromosomica piu` comune nelle neoplasie ematologiche, dopo il cromosoma Philadelphia. L`anormalita` 20q- viene osservata nel 10% dei pazienti con malattie mieloproliferative, di cui la piu` comune e` la Policitemia Vera, nel 4% dei pazienti con malattie mielodisplastiche, e nell`1-2% dei pazienti con Leucemia mieloide acuta. L`inattivazione (o aploinsufficienza) di geni oncosoppressori su 20q potrebbe spiegare la patogenesi di questi disordini. L`espressione di L3MBTL1 nel compartimento ematopoietico (nelle cellule CD34+ che rappresentano le cellule staminali/progenitrici ematopoietiche) e l`assenza di mutazioni a carico dell`allele non deleto, hanno fatto a lungo ipotizzare che l`aploinsufficienza di L3MBTL1 possa contribuire alla patogenesi delle neoplasie ematologiche mieloidi associate alla delezione del cromosoma 20. 1) Per definire il suo ruolo in ematopoiesi e la possibilita` che la sua ridotta espressione nella malattie mieloidi associate a delezione del cromosoma 20 contribuisca alla patogenesi di questi disordini, abbiamo silenziato l`espressione di L3MBTL1 nelle cellule staminali/progenitrici (CD34+) isolate da sangue cordonale (usando short hairpin RNAs). Abbiamo osservato che le cellule staminali emopoietiche deplete per L3MBTL1 dimostrano un aumentato differenziamento verso la linea eritroide. In maniera consistente la overespressione di L3MBTL1 nelle cellule staminali/progenitrici CD34+ come nelle linee cellulari 20q- riduceva il differenziamento eritroide. Inoltre, i livelli endogeni di espressione di L3MBTL1 si riducevano durante il differenziamento eritroide indotto da emina o dall`esposizione a eritropoietina, suggerendo un ruolo specifico per la ridotta espressione di L3MBTL1 nell`indurre le decisioni di differenziamento delle cellule emopoietiche verso la linea eritroide. Il silenziamento di L3MBTL1 aumentava anche la sensibilita` delle cellule staminali progenitrici all`eritropoietina (Epo), con aumentata fosforilazione (indotta da Epo) di STAT5, AKT, and MAPK ed evidente fosforilazione anche in assenza di Epo. Questi dati suggerirono che l`aploinsufficienza di L3MBTL1 contribuisce ad alcune neoplasie mieloproliferative (20q), specialmente la Policitemia Vera, attraverso la promozione del differenziamento eritroide. La Policitemia Vera infatti àƒ¨ una malattia clonale della cellula staminale emopoietica, caratterizzata da una proliferazione persistente ed incontrollata della linea eritropoietica indipendentemente dai meccanismi che fisiologicamente regolano lࢠeritropoiesi. Nella policitemia vera, la proliferazione eritroide àƒ¨ predominante e determina un aumento numerico dei globuli rossi nel sangue periferico. 2) Per investigare il ruolo di L3MBTL1 come oncosoppressore, abbiamo continuato ad utilizzare un approccio ࢠloss-of-functionࢠ, attraverso l`utilizzo di vettori lentivirali che consentono l`espressione di shRNA diretti contro L3MBTL1. Abbiamo trovato che la deplezione di L3MBTL1 nelle cellule umane causa stress replicativo, rottura del DNA, attivazione della risposta al danno del DNA e instabilita` genomica. L3MBTL1 interagisce infatti con Cdc45, MCM2-7 and PCNA, componenti dell`apparato replicativo, necessari per la progressione della replicazione. Questi dati suggeriscono che la delezione di L3MBTL1 causa danno del DNA, tramite la perturbazione della replicazione del DNA. Un`attivata risposta al danno del DNA e l`instabilita` genomica sono aspetti comuni nella tumorigenesi e rappresentano una conseguenza dell`overespressione di molti oncogeni. Questi studi ci hanno consentito di proporre un modello in cui la delezione di L3MBTL1 contribuisce allo sviluppo delle neoplasie ematologiche associate alla delezione del braccio lungo del cromosoma 20 attraverso l`induzione di stress replicativo, danno al DNA e instabilita` genomica. 3) Per definire come L3MBTL1, una proteina del gruppo Polycomb con attivita` trascrizionali di repressione, regola gli eventi iniziali del differenziamento, abbiamo creato delle linee cellulari embrionali che constitutivamente eprimono shRNA diretti contro L3MBTL1. Il silenziamento di L3MBTL1 nelle cellule umane embrionali consentiva una normale morfologia, proliferazione, cinetica di ciclo cellulare, normali marcatori di superficie e cariotipo dopo 40 passaggi.