Ruolo degli agenti microbici nella eziopatogenesi delle vasculopatie e del diabete. Studi su cellule endoteliali vascolari e nuovi target terapeutici di intervento.

MODULAZIONE GENICA E FUNZIONALE DI CELLULE ENDOTELIALI ARTERIOSE E VENOSE INFETTATE IN MODO PERSISTENTE DA COXSACKIEVIRUS B: POSSIBILE RUOLO NEI PROCESSI DI TROMBOGENESI E ATEROSCLEROSI I processi infiammatori svolgono un ruolo di rilievo nella genesi e nella progressione delle lesioni croniche cardiovascolari di natura sia aterosclerotica sia trombotica ed è noto che le alterazioni endoteliali giocano un ruolo centrale in tali processi patologici. In tale ottica deve essere rivalutato il coinvolgimento da tempo ipotizzato degli agenti microbici nella patogenesi dell’aterosclerosi. Tra i microrganismi che sembrano giocare un ruolo nella eziologia dell’aterosclerosi sono compresi sia virus (CMV, HSV, EBV) che batteri (Chlamydia pneumoniae e Helicobacter pylori). Recentemente è stata evidenziata una possibile correlazione tra aterosclerosi, infarto del miocardio e coxsackievirus B (CVBs), agenti virali appartenenti alla famiglia dei Picornaviridae, coinvolti nella eziologia di processi patologici di tipo cronico degenerativo e di cui abbiamo da tempo dimostrato la capacità di infettare le cellule endoteliali (ECs). Poiché le ECs presentano caratteristiche differenti a seconda dell’origine, abbiamo indagato gli effetti funzionali dei CVBs su linee di cellule endoteliali venose e arteriose ottenute e caratterizzate nel nostro laboratorio. L’attività di ricerca si è incentrata sullo studio della interazione tra il ceppo cardiotropico CVB3 e le cellule endoteliali umane e sulla caratterizzazione degli effetti dell’infezione sulle funzioni di tali cellule correlate allo sviluppo di infiammazione e alla regolazione della coagulazione. Lo studio è stato effettuato principalmente su un modello di infezione in vitro di cellule endoteliali vascolari umane immortalizzate il cui fenotipo è stato caratterizzato sulla base dell’espressione di antigeni endotelio-specifici. I recettori dei CVBs (CAR e CD55) sono espressi sia in ECs venose che arteriose ed entrambi i tipi cellulari sostengono una infezione persistente produttiva non citopatica da CVB3. Gli effetti dell’infezione sono stati indagati mediante DNA microarray specifici per pathways funzionali endoteliali e confermati mediante RTPCR semiquantitative, test immunoenzimatici e citofluorimetria. I risultati dimostrano che CVB3 stimola nelle ECs un’aumentata espressione delle citochine pro-infiamatorie IL-1, IL-6 e IL-8. L’incremento è maggiore nelle ECs arteriose, nelle quali si osserva inoltre up regolazione delle chemochina MCP-1, della proteina C reattiva (CRP), di INF-1 e di COX-2, un enzima chiave nelle fasi precoci del processo infiammatorio. In entrambi i tipi di ECs l’infezione determina una down-regolazione delle caderine e delle integrine, molecole particolarmente importanti in quanto coinvolte nella disregolazione delle interazioni cellula-cellula e cellula-matrice che predispone il tessuto vascolare alla formazione di placche ateromasiche instabili e alla trombosi. A carico delle ECs venose CVB3 altera in senso pro-trombotico le funzioni di regolazione della coagulazione, con riduzione dell’espressione dell’ attivatore tessutale del plasminogeno e down-regolazione dell’ inibitore dell’ attività procoagulativa del fattore tessutale. A carico delle ECs arteriose l’effetto pro-aterosclerotico di CVB3 è stato confermato dall’ induzione di IL-18 e INF-, fattori condizionanti lo sviluppo e l’instabilità delle placche ateromasiche e dall’ aumentata espressione delle molecole di adesione e attivazione leucocitaria ICAM-1 e VCAM-1. Allo scopo di provare a identificare nuovi target terapeutici di intervento abbiamo sottoposto, in modo preliminare, le nostre ECs a trattamento con statine. La somministrazione di simvastatina determina nelle ECs infettate una riduzione del “virus yield”, evidenziata dal diminuito rilascio di particelle virali infettanti e dalla ridotta presenza di genoma B3 intracellulare. Inoltre si osserva down regolazione di alcuni importanti markers pro infiammatori (IL-1IL-6, INF-, INF-1 e CRP) con effetti più evidenti nel caso di ECs arteriose infettate. I risultati ottenuti dimostrano come CVB3, virus con tropismo cardiovascolare, possa modulare in modo assai complesso le attività funzionali delle ECs e possa rappresentare un modello per analizzare il ruolo dei CVBs, o di altri virus, nello sviluppo di processi infiammatori cronici vascolari ad esito trombotico e/o aterosclerotico e conseguente sviluppo dello studio di nuove prospettive terapeutiche. MALATTIA PARODONTALE E ATEROSCLEROSI: CORRELAZIONI MICROBIOLOGICHE Da qualche anno si parla sempre più spesso di una correlazione tra salute orale e alcune importanti malattie sistemiche, infatti numerosi studi epidemiologici condotti negli ultimi dieci anni hanno dimostrato come persone che soffrono di malattie parodontali possano manifestare con maggiore frequenza patologie cardiovascolari, diabete, malattie polmonari e nascite premature. Uno dei potenziali meccanismi alla base dell’associazione tra salute parodontale e malattie sistemiche è rappresentato dalla infezione batterica. Diversi studi hanno suggerito una possibile associazione tra periodontiti, batteri parodonto patogeni e lo sviluppo di malattie cardiovascolari. Studi sperimentali hanno dimostrato l’abilità di batteri parodonto patogeni nell’interagire con le cellule endoteliali, nell’indurre proliferazione delle cellule muscolari lisce vascolari e nel causare un rilascio locale di citochine proinfiammatorie. La presenza di questi batteri a livello delle placche aterosclerotiche potrebbe avere un ruolo di rilievo nelle fasi di iniziazione, sviluppo e progressione del processo aterosclerotico stesso. Fino ad ora non sono state trovate e presentate in letteratura delle evidenze complete e molti studi su questa associazione dovrebbero essere ancora condotti. Nel corso di questo studio sperimentale sono stati reclutati una ventina di pazienti per essere sottoposti ad endoarterioectomia, prelievi parodontali/gengivali e di sangue. Tutti i campioni sono stati adeguatamente trasportati, conservati e processati per essere sottoposti ad estrazione di DNA totale e batterico in base a specifici protocolli ottimizzati. Si è proceduto mediante specifiche indagini di biologia molecolare con un approccio di PCR di tipo Multiplex con cui poter individuare in una singola reazione più frammenti di DNA batterico per ciascun campione attraverso l’uso di coppie di primers specifici per i batteri da noi precedentemente selezionati (Actinobacillus actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum, Bacteroides forsythus, Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis). La valutazione di tutte le analisi PCR Multiplex condotte e soprattutto l’accurata osservazione dei rispettivi gels ad esse associate, ci ha permesso di ottenere una serie di risultati preliminari. Dei 20 tamponi parodontali testati tutti infatti sono risultati positivi per Fusobacterium nucleatum (100%), il 70% ha mostrato positività per Prevotella intermedia, il 65% per Porphyromonas gingivalis, mentre il 30% per Actinobacillus actinomycetemcomitans e infine il 10% per Bacteroides forsythus. Delle 20 placche analizzate il 35% sono risultate positive per Fusobacterium nucleatum, il 15% per Prevotella intermedia e il 5% per Porphyromonas gingivalis così come per Actinobacillus actinomycetemcomitans. Le indagini condotte su campioni di sangue intero hanno rilevato una batteriemia in circa il 35% dei casi e di cui il 20% ad opera di Fusobacterium nucleatum, il 5% di Prevotella intermedia così come di Porphyromonas gingivalis. In seguito ad analisi globale e comparativa di tutti i risultati ottenuti nel caso dei tre tipi di campioni indagati, abbiamo evidenziato come in tre pazienti vi sia del DNA batterico in tutti i campioni da loro prelevati (tampone parodontale, placca aterosclerotica e sangue) e in particolar modo come Fusobacterium nucleatum sia generalmente il battere più rappresentato.