AMT-mediated insertional mutagenesis in the biocontrol agent Papiliotrema terrestris PT22AV for assessing the role of Exopolysaccharides (EPS) production in biocontrol activity

Biocontrol of plant diseases enriches food safety and security. This study investigated the role of exopolysaccharides (EPS) in the biocontrol yeast Papiliotrema terrestris strain PT22AV and identified genes involved in EPS production. Using Agrobacterium-mediated transformation (AMT), 700 transformants were generated. Four transformants with reduced EPS production on apple-mimicking media were selected for further analysis. EPS quantification showed lower EPS production in transformants compared to WT. Cell growth assays in 30 nutrient media revealed significant differences in the optical density (OD) mean between transformants and the wild type (WT), with NaNO₃ and uridine showing the lowest growth. Euclidean Distance Measurement clustered WT and EPS–13 together due to similar growth, while EPS–7, EPS–15, and EPS–17 formed a separate group. Under 40X microscopy, transformants and WT showed no significant size or morphological differences. SEM analysis revealed spherical to elliptical shapes of the eps mutants’ cells with distinct structures. In contrast, WT cells, heavily coated with EPS, lacked clear morphology, and no cell size difference between the eps mutants and WT. Biological control assays revealed significant differences in the mean percentage of inhibition and lesion diameter between eps mutants and WT. Dual culture assays showed a significant difference in colony diameter, highlighting the eps mutants’ reduced antagonistic activity against P. expansum. It suggests the role of EPS in WT's biocontrol efficacy. Pearson correlation analysis revealed a strong correlation between EPS production and biocontrol activity, strengthening over a longer incubation period. The pool-DNA sequencing of all four transformants mapped in the Integrative Genomics Viewer (IGV) with the P. terrestris reference genome identified seven T-DNA insertions. One insertion was integrated with both plasmid borders, while six had single border integration. These insertions were located in genes of P. terrestris, which are orthologous to HSV2, AMD2, DAL5, EFM1, NCL1, OCH1, and NSR1 of S. cerevisiae.

Il biocontrollo delle malattie delle piante migliora la sicurezza alimentare. Questo studio ha indagato il ruolo degli esopolisaccaridi (EPS) nel lievito di biocontrollo Papiliotrema terrestris ceppo WT e ha identificato i geni coinvolti nella produzione di EPS. Utilizzando la trasformazione mediata da Agrobacterium (AMT), sono stati generati 700 trasformanti. Quattro trasformanti con ridotta produzione di EPS su terreni che imitano la mela sono stati selezionati per ulteriori analisi. La quantificazione dell'EPS ha mostrato una minore produzione di EPS nei trasformanti rispetto ai WT. I saggi di crescita cellulare in 30 mezzi nutritivi hanno rivelato differenze significative nella densità ottica media (OD) tra i trasformanti e il tipo selvatico (WT), con NaNO₃ e uridina che hanno mostrato la crescita più bassa. La misurazione della distanza euclidea ha raggruppato WT ed EPS–13 insieme a causa di una crescita simile, mentre EPS–7, EPS–15 ed EPS–17 hanno formato un gruppo separato. Al microscopio 40X, i trasformanti e la WT non hanno mostrato differenze significative tra le dimensioni o la morfologia. L'analisi SEM ha rivelato una forma da sferica a ellittica delle cellule dei mutanti EPS con strutture distinte, mentre le cellule WT, pesantemente rivestite di EPS, mancavano di una morfologia chiara e nessuna differenza di dimensione cellulare tra i mutanti EPS e WT. I test di controllo biologico hanno rivelato differenze significative nella percentuale media di inibizione e nel diametro della lesione tra i mutanti EPS e WT. I test di doppia coltura hanno rivelato una differenza significativa nel diametro della colonia, evidenziando che i mutanti EPS hanno ridotta attività antagonista contro P. expansum. Ciò suggerisce il ruolo dell'EPS nell'efficacia del biocontrollo del WT. L'analisi di correlazione di Pearson ha rivelato una forte correlazione tra la produzione di EPS e l'attività di biocontrollo, rafforzandosi per periodi di incubazione più lunghi. Il sequenziamento pool-DNA di tutti e quattro i trasformanti mappati nell'Integrative Genomics Viewer (IGV) con il genoma di riferimento di P. terrestris ha identificato sette inserzioni di T-DNA. Un'inserzione si è integrata con entrambi i bordi plasmidici, mentre sei hanno avuto un'integrazione a bordo singolo. Queste inserzioni sono state localizzate in geni di P. terrestris, che sono ortologhi a HSV2, AMD2, DAL5, EFM1, NCL1, OCH1 e NSR1 di S. cerevisiae.