Engineering of protein-rich biomass: from organic waste to functional bioplastic films

The transition from a linear to a circular production system involves the transformation of waste into valuable resources. In this context, the disposal of the Organic Fraction of Municipal Solid Waste (OFMSW) poses a significant challenge, reaching 1.3 billion tonnes/year globally and expected to increase by 70% within 2050 due to a rise in global population and, thus, in food waste and by-products. Insect-mediated bioconversion, particularly using black soldier fly (BSF) larvae, can offer a promising opportunity to convert up to 80% in weight of the OFMSW into a protein-rich biomass, along with lipids and chitin as additional products. In this Thesis, proteins derived from the BSF were characterized and engineered, and proof-of-concepts for their valorization were proposed by repurposing them as building blocks of bioplastics, adhering to green chemistry principles in their fabrication processes. The first study of this Thesis presents a proof-of-concept of a circular supply chain that, starting from the bioconversion of the OFMSW through BSF larvae, led to the production of a first generation of BSF protein-based biodegradable bioplastics, offering high technological potential. In collaboration with research partners from UniInsubria (Varese), it was demonstrated that BSF larvae reared either on standardized or real OFMSW substrates displayed excellent growth and bioconversion rates. On a second level, the study focused on protein extracts obtained from two developmental stages of the insect, namely larvae and pupae, which were found to differ significantly in their proteomes. In particular, pupae proteins displayed a pool of polypeptides characterized by higher MWs, a factor suggested to be at the base of the unprecedented stretchability of bioplastic films deriving from these proteins. In addition, the thermal-, chemical- and bio-degradability of proposed bioplastics were investigated evidencing high potential for future developments. Overall, this study demonstrated the feasibility of a new integrated circular supply chain for the valorization of the OFMSW, and provided useful insights into the main properties of BSF protein-derived bioplastics together with correlations between proteins’ structures and film’s properties. The second study investigated the creation of an electroconductive bionanocomposite material for flexible electronics, starting from a combination of BSF pupae proteins with a functionalized conductive carbon black (CCB). The benefits of functionalizing CCB with a serinol pyrrole (SP) have been demonstrated: when compared to reference composites, CCB/SP containing ones provided a higher filler-matrix dispersion, ultimately leading to higher electro-conductivity. To enhance their water stability, a hydrophobic layer was applied on prepared bionanocomposites via low-pressure cold plasma (LPCP) polymerization of hexamethyldisiloxane (HDMSO). Endowed with high conductivity, strain-sensing properties, high surface hydrophobicity, and the possibility to recover CCB via enzymatic degradation of the protein matrix, the materials presented in this study well-suit the requirements for disposable flexible electronics, as in wearable devices or packaging for electrostatic discharge and electromagnetic interference shielding. In the third study of this Thesis, the self-assembly of BSF proteins into amyloid fibrils was investigated through various techniques (ThT assays, TEM, XRD), demonstrated, and implemented in the fabrication of bioplastic films for packaging applications. Blended films of fibrillated BSF proteins with polyvinyl alcohol (PV-OH) and glycerol were obtained through a simple and scalable wet processing, using water as the only solvent and avoiding harmful additives. Obtained films exhibited transparency, flexibility, thermal processability, and exceptional mechanical and gas barrier properties, comparable to engineering plastics. The materials from BSF proteins presented in this work not only offer a tangible proof towards the real valorization of BSF proteins, but also provide a valuable alternative to current oil-based films for multilayered packaging. The fourth and last study advanced the development of a sustainable technology in collaboration with the industrial partner ENI S.p.a. (DPELab/B). The contents of this study are not reported in this Thesis file for confidentiality reasons.

La transizione da un sistema di produzione lineare a uno circolare implica la trasformazione dei rifiuti in risorse preziose. In questo contesto, la gestione della Frazione Organica dei Rifiuti Solidi Urbani (FORSU) rappresenta una sfida significativa, raggiungendo globalmente 1,3 miliardi di tonnellate/anno, con una previsione di aumento del 70% entro il 2050, a causa dell'incremento della popolazione globale e, di conseguenza, dei rifiuti alimentari e dei sottoprodotti. La bioconversione mediata da insetti, in particolare mediante l'uso delle larve di mosca soldato nera (BSF), può offrire una promettente opportunità per convertire fino all'80% del peso della FORSU in una biomassa ricca di proteine, insieme a lipidi e chitina come prodotti aggiuntivi. In questa tesi, le proteine derivate dalla BSF sono state caratterizzate e ingegnerizzate, e sono stati proposti dei proof-of-concept per la loro valorizzazione, riutilizzandole come building-blocks per la produzione di bioplastiche, seguendo i principi della chimica verde nei loro processi di fabbricazione. Il primo studio di questa tesi presenta un proof-of-concept di una catena di approvvigionamento circolare che, partendo dalla bioconversione della FORSU attraverso le larve di BSF, ha portato alla produzione di una prima generazione di bioplastiche biodegradabili a base di proteine di BSF, offrendo un alto potenziale tecnologico. In collaborazione con i partner di ricerca dell'UniInsubria (Varese), è stato dimostrato che le larve di BSF allevate su substrati standardizzati o reali di FORSU mostrano ottimi tassi di crescita e bioconversione. A un livello successivo, lo studio si è concentrato sugli estratti proteici ottenuti da due stadi di sviluppo dell'insetto, ovvero larve e pupe, che sono risultati significativamente differenti a livello di proteoma. In particolare, le proteine delle pupe hanno mostrato un pool di polipeptidi caratterizzati da pesi molecolari superiori, un fattore che si suggerisce essere alla base della straordinaria estensibilità dei film bioplastici derivanti da questa tipologia di estratto proteico. Inoltre, sono state investigate la termodegradabilità, la degradabilità chimica e bio-degradabilità delle bioplastiche proposte, evidenziando un alto potenziale per sviluppi futuri. Complessivamente, questo studio ha dimostrato la fattibilità di una nuova catena di approvvigionamento circolare integrata per la valorizzazione della FORSU e ha fornito utili informazioni sulle principali proprietà delle bioplastiche derivate dalle proteine della BSF, insieme a correlazioni tra le strutture proteiche e le proprietà dei film. Il secondo studio ha investigato la creazione di un materiale bionanocomposito elettroconduttivo per l'elettronica flessibile, partendo da una combinazione di proteine di pupe di BSF con un carbon black conduttivo funzionalizzato (CCB). Sono stati dimostrati i benefici della funzionalizzazione del CCB con serinol pirrolo (SP): rispetto ai compositi di riferimento, quelli contenenti CCB/SP hanno mostrato una maggiore dispersione filler-matrice, portando infine a una maggiore elettroconduttività. Per migliorarne la stabilità in acqua, è stato applicato uno strato idrofobico sui bionanocompositi preparati tramite polimerizzazione a plasma freddo a bassa pressione (LPCP) di esametildisilossano (HDMSO). Dotati di alta conducibilità, proprietà di rilevamento della deformazione, alta idrofobicità superficiale e la possibilità di recuperare il CCB tramite degradazione enzimatica della matrice proteica, i materiali presentati in questo studio sono ideali per le esigenze dell'elettronica flessibile usa e getta, come nei dispositivi indossabili o nel packaging per la protezione da scariche elettrostatiche e interferenze elettromagnetiche. Nel terzo studio di questa tesi, è stata investigato l'auto-assemblaggio di proteine da pupe di BSF in fibrille amiloidi tramite varie tecniche (prove ThT, TEM, XRD), implementandolo nella fabbricazione di film bioplastici per applicazioni in campo packaging. I film ibridi, costituiti da proteine BSF fibrillate, alcol polivinilico (PV-OH) e glicerolo, sono stati ottenuti mediante un processo semplice e scalabile, utilizzando l'acqua come unico solvente ed evitando additivi tossici per l'uomo e l'ambiente. I film ottenuti hanno mostrato trasparenza, flessibilità, processabilità termica ed eccezionali proprietà meccaniche e di barriera ai gas, comparabili a quelle delle plastiche ingegneristiche. I materiali derivanti dalle proteine della BSF presentati in questo lavoro non solo offrono una prova tangibile verso la valorizzazione reale delle proteine della BSF, ma forniscono anche una valida alternativa alle attuali pellicole a base di petrolio per il packaging multi-strato. Il quarto e ultimo studio ha previsto lo sviluppo di una tecnologia sostenibile in collaborazione con il partner industriale ENI S.p.A. (DPELab/B). I contenuti di questo studio non sono riportati in questo file per motivi di riservatezza.