Automatic Label-Free system for cell viability on-a-chip [Sistema automatico Label-Free per la determinazione della vitalità cellulare su chip]

Microfluidic platforms have emerged as powerful tools for the analysis of small volume biological samples within precisely controlled environments. In the context of cell viability assessment, conventional approaches typically rely on chemical labeling, which is invasive, time-consuming, and limited to endpoint analysis, preventing sample reuse and requiring bulky and expensive instrumentation such as flow cytometers. These limitations motivate us to the development of automatic, non-invasive, and portable systems capable of evaluating cell viability directly on-a-chip, while preserving sample integrity and reducing operational complexity. This thesis presents a breakthrough paradigm for cell viability monitoring and assessment, integrating hydrodynamic actuation with optical sensing within a microfluidic platform, named Hy-based μFlu Viability Analysis. By exploiting the mechanobiological response of cells under continuous hydrodynamic stimulation, the Hy-based μFlu Viability approach transforms cell motion dynamics into quantitative viability-related biomarkers. Specifically, a Digital Particle Image Velocimetry (DPIV)–based algorithm was employed to reconstruct cell velocity profiles and extract two biomarkers related to the cells’ dynamic response in both the time and frequency domains, which proved effective for viability classification. This methodology was fully automated through a cyclic algorithmic framework that performs video acquisition, data analysis, and visualization every predefined Time-Slot, enabling continuous and unsupervised monitoring of cell populations viability. Its reliability and generalizability were validated on multiple cell lines, including HL60 and HeLa in different viability status, and benchmarked against the standard MTT assay, revealing strong consistency between metabolic and mechanical viability indicators. Additionally, to overcome the computational demands inherent to image-based processing and to move from cyclic Time-Slot to real-time analysis, a deep learning model, named Average Particles Velocity network (APVnet), was developed to estimate cell velocity in real-time, achieving video-rate performance suitable for edge deployment. Finally, the methodology was transferred onto two compact and portable technological platforms, bridging the gap between laboratory research and real-world deployable systems. The first is a smartphone-based reflective microscope, the Smart-Reflex-Scope, that leverages the smartphone’s built-in camera and flash to perform on-a-chip imaging through a custom reflective optical configuration. The second is a fully integrated micro-optofluidic chip that replaces full-field imaging with in-situ optical signaling using the Dual-Slit Particle Signal Velocimetry (DPSV) technique. The proposed system represents a significant step forward toward automated, label-free, and real-time cell viability monitoring within microfluidic chip. By combining hydrodynamics, optics, artificial intelligence and low-cost, portable solutions, this work lays the foundation for next-generation point-ofcare diagnostic tools, fostering accessible, sustainable, and information-rich bioanalysis for decentralized healthcare and drug discovery applications.

Le piattaforme microfluidiche sono emerse come strumenti potenti per l’analisi di campioni biologici di piccolo volume in ambienti controllati con precisione. Nel contesto della valutazione della vitalità cellulare, gli approcci convenzionali si basano tipicamente sulla marcatura chimica, una procedura invasiva, dispendiosa in termini di tempo e limitata ad analisi di tipo endpoint, che impedisce il riutilizzo dei campioni e richiede strumentazioni ingombranti e costose, come i citofluorimetri a flusso. Queste limitazioni hanno motivato lo sviluppo di sistemi automatici, non invasivi e portatili, in grado di valutare la vitalità cellulare direttamente on-a-chip, preservando l’integrità del campione e riducendo la complessità operativa. La presente tesi introduce un paradigma innovativo per il monitoraggio e la valutazione della vitalità cellulare, integrando l’attuazione idrodinamica con la rilevazione ottica all’interno di una piattaforma microfluidica denominata Hy-based μFlu Viability Analysis. Sfruttando la risposta meccano-biologica delle cellule sottoposte a stimolazione idrodinamica continua, l’approccio Hy-based μFlu Viability trasforma le dinamiche di movimento cellulare in biomarcatori quantitativi correlati alla vitalità. In particolare, è stato impiegato un algoritmo basato sulla Digital Particle Image Velocimetry (DPIV) per ricostruire i profili di velocità cellulare ed estrarre due biomarcatori legati alla risposta dinamica delle cellule nei domini del tempo e della frequenza, risultati efficaci per la classificazione della vitalità. Questa metodologia è stata completamente automatizzata tramite un framework algoritmico ciclico che esegue acquisizione video, analisi dei dati e visualizzazione a intervalli di tempo predefiniti (Time-Slot), consentendo un monitoraggio continuo e non supervisionato della vitalità delle popolazioni cellulari. L’affidabilità e la generalizzabilità del metodo sono state validate su diverse linee cellulari, tra cui HL60 e HeLa in differenti stati di vitalità, e confrontate con il test standard MTT, evidenziando una forte coerenza tra gli indicatori di vitalità metabolici e meccanici. Inoltre, per superare le esigenze computazionali intrinseche all’elaborazione basata su immagini e passare da un’analisi ciclica Time-Slot a una analisi in tempo reale, è stato sviluppato un modello di deep learning denominato Average Particles Velocity network (APVnet), capace di stimare la velocità cellulare in tempo reale, raggiungendo prestazioni a velocità video adatte all’implementazione su dispositivi edge. Infine, la metodologia è stata trasferita su due piattaforme tecnologiche compatte e portatili, colmando il divario tra ricerca di laboratorio e sistemi realmente implementabili. La prima è un microscopio a riflessione basato su smartphone, denominato Smart-Reflex-Scope, che sfrutta la fotocamera e il flash integrati del dispositivo per realizzare imaging on-a-chip mediante una configurazione ottica riflettente personalizzata. La seconda è un chip micro-optofluidico completamente integrato che sostituisce l’imaging a campo pieno con la rilevazione della velocità in-situ tramite segnali ottici basata sulla tecnica Dual-Slit Particle Signal Velocimetry (DPSV). Il sistema proposto rappresenta un passo significativo verso il monitoraggio automatico, label-free e in tempo reale della vitalità cellulare all’interno di chip microfluidici. Combinando idrodinamica, ottica, intelligenza artificiale e soluzioni portatili a basso costo, questo lavoro getta le basi per la prossima generazione di strumenti diagnostici point-of-care, promuovendo un’analisi biochimica accessibile, sostenibile e ricca di informazioni per applicazioni nella sanità decentralizzata e nella scoperta di nuovi farmaci.