VDAC1P8 as a Novel Regulatory Element in Leukemogenesis: Integrative Genomic, Epigenetic, and Functional Insights [VDAC1P8 come nuovo elemento regolatorio nella leucemogenesi: approfondimenti genomici, epigenetici e funzionali integrati]

Mitochondria are essential organelles for eukaryotic cells as they support the high energy demand required to maintain cellular homeostasis. Communication between the cytosol and mitochondria is mediated by mitochondrial porins, also known as Voltage-Dependent Anion Selective Channels (VDACs), which are located in the outer mitochondrial membrane of all eukaryotes. VDAC proteins facilitate the exchange of metabolites and participate in numerous cellular pathways through their interaction with specific cytosolic enzymes and apoptotic factors. In mammals, there are three distinct isoforms: VDAC1, VDAC2, and VDAC3. Despite their high sequence homology, these isoforms have different functions and characteristics. In particular, VDAC1 is frequently overexpressed in tumors, and one of the most studied aspects is its interaction with hexokinase, a crucial enzyme in glucose metabolism. The stable association between VDAC1 and hexokinase is a key element in the Warburg effect, a phenomenon characteristic of cancer cells, where energy metabolism shifts from mitochondrial oxidative phosphorylation to anaerobic glycolysis, even in the presence of oxygen. This alteration allows cancer cells to meet their metabolic demands for rapid proliferation and to reduce the production of reactive oxygen species (ROS), thereby minimizing oxidative damage. The interaction between VDAC1 and hexokinase not only supports glycolysis but also prevents VDAC1 from binding to pro-apoptotic proteins such as Bax and Bak. These proteins are essential for initiating apoptosis as they facilitate the release of apoptotic factors, such as cytochrome c, from the mitochondria into the cytoplasm. When VDAC1 is bound to hexokinase, its ability to interact with Bax and Bak is inhibited, contributing to apoptosis resistance, another hallmark of cancer cells. In this context, VDAC1 acts as a central modulator linking energy metabolism to cell survival, making it an attractive target for therapeutic strategies. At the same time, pseudogenes are gaining increasing attention in tumorigenic processes. Traditionally considered non-functional genomic fragments, some pseudogenes have been found to actively regulate gene expression, often acting as ceRNAs (competitive endogenous RNAs) by sequestering microRNAs (miRNAs) shared with their parental genes and modulating their expression. This regulatory 3 mechanism, similar to that observed for lncRNAs, represents a potential tool for controlling gene expression and is increasingly recognized in many diseases, particularly cancer. Little is known about the pseudogenes of VDAC. Since the factors and circumstances regulating VDAC gene expression are still under investigation, understanding whether their pseudogenes are involved or play a role could provide important insights into the regulatory network controlling the expression of VDAC isoforms. To address this gap, this doctoral thesis conducts an in-silico and in vitro analysis of the physiological and clinical implications of the processed pseudogenes of human VDAC genes. By leveraging multiple genomic and transcriptomic databases, we observed that some VDAC pseudogenes are transcribed in specific tissues and pathological states. Our experimental data revealed a connection between the pseudogene VDAC1P8 and acute myeloid leukemia (AML) and in colorectum cancer (CRC). A comparative in-silico analysis of the VDAC1 gene and its pseudogene, VDAC1P8, combined with experimental data obtained from AML cellular models, revealed that the specific overexpression of VDAC1P8 is associated with the downregulation of the parental VDAC1 gene. These findings suggest that VDAC1P8 could represent a potential biomarker for AML and open new opportunities to study the regulatory mechanisms of VDAC1P8 and its possible role in the pathogenesis of AML.

I mitocondri sono organelli essenziali per le cellule eucariotiche, poiché supportano l'enorme richiesta energetica necessaria per mantenere l'omeostasi cellulare. La comunicazione tra il citosol e i mitocondri è mediata dalle porine mitocondriali, note anche come Voltage-Dependent Anion Selective Channels (VDAC), localizzate nella membrana mitocondriale esterna di tutti gli eucarioti. Le proteine VDAC consentono lo scambio di metaboliti e partecipano a numerosi processi cellulari grazie alla loro interazione con specifici enzimi citosolici e fattori apoptotici. Nei mammiferi sono presenti tre diverse isoforme: VDAC1, VDAC2 e VDAC3. Pur condividendo un'alta omologia di sequenza, queste isoforme presentano funzioni e caratteristiche distinte. In particolare, VDAC1 è frequentemente sovraespresso nei tumori, ed uno degli aspetti più studiati è la sua interazione con l'esochinasi, un enzima cruciale nel metabolismo del glucosio. L'associazione stabile tra VDAC1 ed esochinasi è un elemento chiave dell'effetto Warburg, un fenomeno caratteristico delle cellule tumorali, in cui il metabolismo energetico è deviato dalla fosforilazione ossidativa mitocondriale verso la glicolisi anaerobica, anche in presenza di ossigeno. Questa alterazione consente alle cellule tumorali di soddisfare le proprie esigenze metaboliche per una rapida proliferazione e di ridurre la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), minimizzando il danno ossidativo. L'interazione tra VDAC1 ed esochinasi non solo favorisce la glicolisi, ma impedisce anche a VDAC1 di legarsi a proteine pro-apoptotiche come Bax e Bak. Queste proteine sono essenziali per l'induzione dell'apoptosi, In questo contesto, VDAC1 funge da modulatore centrale che collega il metabolismo energetico alla sopravvivenza cellulare, rendendolo un bersaglio particolarmente interessante per strategie terapeutiche mirate. Sebbene le proteine della famiglia VDAC, ed in particolare l’isoforma VDAC1, sono state ben caratterizzate nella loro funzione di canale e si conosce in alcuni casi il loro ruolo all’interno della cellula, poco si conosce a riguardo dei meccanismi di regolazione dell’espressione delle tre diverse isoforme. Solo recentemente sono stati delineati alcuni aspetti che riguardano la regolazione, dei meccanismi trascrizionali dei tre geni, riconducibili all’azione di alcuni fattori di trascrizione e del meccanismo epigenetico della metilazione grazie sia ad un approccio bioinformatico che sperimentale. 1 In questo contesto abbiamo cominciato ad esplorare anche possibili meccanismi di regolazione genica post-trascrizionali mediati dagli pseudogeni data l’elevata numerosità identificata per le isoforme VDAC. Infatti gli pseudogeni stanno guadagnando sempre più attenzione nei processi tumorigenici. Tradizionalmente considerati frammenti genici privi di funzione, è stato dimostrato che alcuni pseudogeni regolano attivamente l’espressione genica, spesso agendo come ceRNA (RNA endogeni competitivi), sequestrando microRNA condivisi con i geni parentali e modulandone l’espressione. Questo meccanismo di regolazione, simile a quello osservato per i lncRNA, rappresenta un potenziale strumento di controllo dell’espressione genica ed è sempre più riconosciuto in molte patologie, in particolare nei tumori. Poco o nulla si sa riguardo agli pseudogeni VDAC. Poiché i fattori e le circostanze che regolano l'espressione dei geni VDAC sono ancora in fase di studio, comprendere se vi sia un coinvolgimento o un ruolo per i loro pseudogeni potrebbe fornire una chiave importante per svelare la rete regolatoria che governa l’espressione delle isoforme VDAC. Con il lavoro svolto in questa tesi di dottorato è stata eseguita un'analisi in-silico e in vitro per caratterizzare gli pseudogeni funzionali del gene parentale VDAC1 e i potenziali meccanismi regolatori che potrebbero spiegare il ruolo biologico di VDAC1 in condizioni fisiologiche e patologiche. Incrociando i dati di più database genomici e trascrittomici, è stata osservata una correlazione tra le variazioni dei livelli di espressione del gene VDAC1 e di alcuni pseudogeni, in particolare lo pseudogene VDAC1P8, che ha indirizzato la nostra attenzione su alcuni tumori, la leucemia mieloide acuta (AML) e il cancro al colon retto (COAD). Per esempio, l'analisi comparativa in-silico tra il gene VDAC1 e il suo pseudogene, VDAC1P8, combinata con dati sperimentali ottenuti da modelli cellulari di AML, ha rivelato che la sovraespressione specifica di VDAC1P8 è associata alla downregulation del gene parentale VDAC1. Questi risultati indicano che VDAC1P8 potrebbe rappresentare un potenziale biomarcatore per AML e aprono nuove possibilità per lo studio dei meccanismi regolatori di VDAC1P8 e del suo possibile ruolo nella patogenesi dell’AML.