BASE EDITING OF AN UPSTREAM ORF IN SCN1A ENHANCES TRANSLATION TO RESTORE GENE DOSAGE IN DRAVET SYNDROME

I canali del sodio voltaggio-dipendenti (VGSC) sono essenziali per il controllo dell’attività elettrica cellulare, e mutazioni nei geni SCN, che codificano per le subunità α di questi canali (NaV), possono causare gravi patologie neurologiche e non neurologiche. Tra queste, le encefalopatie epilettiche dello sviluppo (DEE), in particolare la sindrome di Dravet (DS), rappresentano alcune delle forme più severe. La SD è causata da mutazioni eterozigoti nel gene SCN1A, che determinano una perdita di funzione della proteina NaV1.1, espressa principalmente negli interneuroni GABAergici. Ne conseguono aploinsufficienza del canale e uno sbilanciamento tra segnali eccitatori e inibitori, con compromissione della trasmissione inibitoria e insorgenza di crisi epilettiche. Le attuali terapie geniche mirano a ripristinare l’espressione di SCN1A, ma richiedono interventi a lungo termine e somministrazioni ripetute. In questo studio abbiamo identificato un nuovo meccanismo regolatorio nei geni SCN, in cui le upstream open reading frames (uORF) presenti nella regione non tradotta al 5′ (5′UTR) esercitano un ruolo inibitorio nella produzione della proteina. Abbiamo ipotizzato che l’eliminazione di queste uORF potesse aumentare la sintesi delle proteine NaV funzionali, offrendo così una strategia terapeutica duratura per la DS. A tale scopo, abbiamo sviluppato una strategia di adenine base editing (ABE_uORF) capace di interrompere con precisione le uORF conservate tra uomo e topo nel gene SCN1A. Questo approccio ha determinato un aumento dei livelli di NaV1.1 e il ripristino dell’attività elettrofisiologica nei neuroni derivati da topi Dravet, con effetti di off-target minimi, a dimostrazione della sua sicurezza e specificità. La somministrazione in vivo di vettori AAV contenenti ABE_uORF in topi Dravet perinatali ha prodotto miglioramenti dose-dipendenti nella soglia delle crisi epilettiche termo-indotte e nella sopravvivenza. Inoltre, la conservazione di questo meccanismo regolato da uORF in altri geni SCN suggerisce che l’approccio testato potrebbe essere ampiamente applicabile a diverse patologie da aploinsufficienza correlate agli SCN, come ulteriormente supportato dai nostri dati preliminari relativi a SCN2A e SCN8A. Complessivamente, i nostri risultati indicano che la soppressione permanente delle uORF inibitorie potrebbe rappresentare un trattamento duraturo e indipendente dal tipo di mutazione per la sindrome di Dravet e altre patologie da aploinsufficienza correlate.

Voltage-gated sodium channels (VGSCs) are crucial for controlling the electrical activity of cells and mutations in SCN genes, which encode the α subunits of these channels (NaV), can lead to severe neurological and non-neurological conditions. Among these, Developmental Epileptic Encephalopathies (DEE), particularly Dravet syndrome (DS), are some of the most devastating. DS results from heterozygous mutations in the SCN1A gene, causing loss of function of NaV1.1, which is mainly expressed in GABAergic interneurons. This leads to haploinsufficiency of the channel and a disruption in the balance between excitatory and inhibitory signals, impairing inhibitory function and ultimately causing seizures. Current treatments aim to restore SCN1A expression, often requiring lifelong intervention and therapeutic re-dosing. In this study, we uncovered a novel regulatory mechanism in SCN genes, where upstream open reading frames (uORFs) in the 5′ untranslated region (UTR) suppress the production of the full-length protein. We hypothesized that disrupting these uORFs could increase the synthesis of functional NaV proteins and provide a long-lasting therapeutic strategy for DS. To test this hypothesis, we developed an adenine base editing strategy (ABE_uORF), which precisely disrupts the human-mouse conserved uORFs of the SCN1A gene. This approach successfully increased NaV1.1 protein levels and restored normal firing activity in neurons derived from DS mice, with minimal off-target effects, demonstrating its safety and specificity. In vivo delivery of dual AAV vectors encoding ABE_uORF in neonatal DS mice resulted in dose-dependent improvements in thermal seizure threshold and survival. Importantly, the conservation of this uORF-regulated mechanism across other SCN genes suggests that this ABE approach could be broadly applicable to a variety of SCN-related haploinsufficiency disorders, as supported by our preliminary findings in the context of SCN2A and SCN8A. Collectively, our findings highlight that permanently disrupting inhibitory uORFs could offer a durable and mutation-agnostic treatment for DS and similar haploinsufficiency diseases.