Insight into the physiological and antiviral roles of IFITM proteins

Le proteine trans-membrana indotte dall'interferone (IFITM) sono una famiglia di fattori stimolati dall'interferone noti principalmente per le loro attività antivirali. Qui riportiamo una nuova attività secondaria dell'IFITM3 nella riparazione del DNA, derivante dall'osservazione che essa è prevalentemente nucleare nei macrofagi derivati dai monociti umani (hMDM) e viene indotta da fattori di stress genotossici. La deplezione di IFITM3 ha portato a difetti di riparazione delle rotture a doppio filamento (DSB) osservati in cellule primarie quiescenti, come hMDM e cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC), che si affidano principalmente alla riparazione non omologa (NHEJ). Inoltre, in cellule proliferanti come le THP1 la riparazione dei DSB è solamente ritardata. Ripristinare un mutante nucleare di IFITM3 è sufficiente per risolvere il difetto di riparazione. Studi sull'interattoma di IFITM3 identificano i fattori NHEJ, KU70 e DNA-PKcs come suoi interattori diretti. In linea con ciò, le cellule carenti di IFITM3 hanno mostrato una ridotta efficienza NHEJ, mentre non sono stati osservati cambiamenti significativi in termini di riparazione diretta omologa (HDR) Inoltre, le cellule deplete per IFITM3 mostrano una ipoattivazione di DNA-PKcs mediante fosforilazione del residuo S2056 in risposta al danno al DNA. La mutazione delle lisine nel dominio conservato del loop intracellulare (CIL) di IFITM3 comporta difetti della riparazione dei DSB in hMDM e THP1, ma mantiene la sua capacità di interagire con DNA-PKcs. Per studiare i fattori determinanti della localizzazione nucleare dell'IFITM3, abbiamo eseguito un'analisi western blot su frazionamento nucleare e citosolico, osservando una nuovo prodotto derivante da IFITM3 caratterizzata da un peso molecolare inferiore. Inoltre, abbiamo osservato che questo prodotto localizza nella frazione proteica solubile, suggerendo una possibile scissione del dominio transmembrana C-terminale. Al fine di valutare l'impatto dei IFITM3 in risposta al danno al DNA indotto dalla chemioterapia, abbiamo sfruttato diversi modelli in vitro di AML, quali THP1, HL60, MOLM13 e OCI-AML3. In particolare, abbiamo osservato una maggiore sensibilità al trattamento con daunorubicina nelle cellule con deplezione di IFITM3 e una ridotta capacità di migrazione. Nel loro insieme, questi risultati suggeriscono che l'IFITM3 nucleare svolge un ruolo nelle risposte al danno al DNA mediate dall'NHEJ, a sostegno di un effetto diretto di questo fattore immunitario innato nella fisiopatologia del cancro, fornendo informazioni utili per lo sviluppo di nuove terapie antitumorali.

The interferon-induced transmembrane proteins (IFITMs) are a family of Interferon stimulated factors mainly known for their antiviral activities. Here, we report a novel moonlighting activity for IFITM3 in DNA repair that stems from the observation that it is predominantly nuclear in terminally differentiated human monocyte-derived macrophages (hMDM) at steady-state and induced by genotoxic stressors. Genetic depletion of IFITM3 led to double-strand break (DSB) repair defects observed in primary, quiescent cells, such as hMDM and Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) that rely mainly on Non Homologous End Joining (NHEJ) for repair. Interestingly, only a delayed DSB repair was observed in cycling THP1 cells. A strictly nuclear IFITM3 mutant fully rescued the repair defect, while plasma membrane confined IFITM3 failed to restore repair upon DNA damage. IFITM3 interactome and biochemical studies identify NHEJ factors KU70 and DNA-PKcs as direct interactors of IFITM3. In agreement, IFITM3 deficient cells showed reduced NHEJ efficiency, while no significant changes were observed in terms of Homologous Direct Repair (HDR). Moreover, IFITM3 depleted cells display impaired DNA-PKcs activation by phosphorylation of S2056 residue in response to DNA damage. Mutation of lysins in the conserved intracellular loop (CIL) domain of IFITM3 resulted in impaired repair of DSBs in hMDM and THP1, while retaining interaction with DNA-PKcs. To investigate the determinants of nuclear IFITM3 localization we performed western blot analysis on nuclear and cytosolic fractionations. A smaller IFITM3 product characterized by a lower molecular weight was detected specifically in the nuclear fraction. Moreover, this fragment localized in the soluble protein fraction, suggesting that cleavage of the C-terminal transmembrane domain would allow release of IFITM3 within the nucleus. To evaluate the impact of IFITM3 in response to chemotherapy induced DNA damage we took advantage of different AML in vitro models, such as THP1, HL60, MOLM13 and OCI-AML3. IFITM3 depleted cells were more sensitive to Daunorubicin treatment and showed decreased migration capacity. Together, these results suggest that nuclear IFITM3 plays a role in NHEJ mediated DNA damage responses, supporting a direct effect of this innate immune factor in cancer physiopathology, informing the development of novel anticancer therapies.