Dissecting the pathophysiology of CAR-T cell related neurotoxicity to identify new actionable targets

La sindrome da neurotossicità associata alle cellule effettrici immunitarie (ICANS) rappresenta una complicazione della terapia con cellule T ingegnerizzate con recettore chimerico antigenico (CAR-T). Ne abbiamo studiato le basi cellulari e molecolari in un modello murino umanizzato mediante cellule staminali progenitrici ematopoietiche, che consente interazioni CAR-T/tumore in un sistema immunitario umano, e in un modello in vitro completamente umano di barriera ematoencefalica (BEE), costituito da cellule endoteliali, murali e astrocitarie differenziate da cellule staminali pluripotenti indotte. Circa il 50% dei topi trattati con cellule 19.28ζ CAR-T sviluppa emorragie multifocali cerebrali. L’analisi in risonanza magnetica evidenzia un evento di extravasazione, compatibile con una compromissione della BEE, confermata anche dalla presenza del colorante Evans Blue nel tessuto cerebrale. Deficit locomotori indicano disfunzioni neurovascolari funzionali. In accordo con dati clinici, le emorragie sono più frequenti nei topi con sindrome da rilascio di citochine severa, suggerendo l’infiammazione indotte dalle cellule CAR-T amplifichi la disfunzione della BEE e gli esiti neurotossici. L’analisi di trascrittomica spaziale ad alta risoluzione tramite piattaforma Xenium-5K ha permesso di mappare popolazioni cerebrali neuronali e non neuronali, rivelando una risposta coordinata della BEE alla terapia CAR-T. Gli astrociti fibrosi Gfap⁺Serpina3n⁺ definiscono nicchie reattive associate a compromissione degli interneuroni GABAergici Pvalb⁺, con conseguente perdita della connettività funzionale e ipereccitabilità dei circuiti neuronali. Le cellule endoteliali mostrano attivazione infiammatoria e riduzione di programmi specifici dell’endotelio cerebrale, indicativa di perdita dell’identità endoteliale del sistema nervoso centrale e destabilizzazione delle giunzioni. Nel modello in vitro di BEE, i sieri di pazienti CAR-T affetti da ICANS inducono calo della resistenza elettrica transendoteliale, aumento della permeabilità e attivazione astrocitaria. Il trattamento in preventivo e in terapeutico con un cocktail di molecole che rinforza l’integrità della barriera ripristina la funzionalità endoteliale e riduce l’attivazione astrocitaria. Il modello inoltre conferma il minor potenziale neurotossico di prodotti CAR-T arricchiti in cellule naïve/memory rispetto a quelle effettrici. I nostri risultati identificano la destabilizzazione endoteliale come driver precoce e modulabile del danno neurovascolare, capace di amplificare l’attivazione gliale e il suo ripristino riduce le alterazioni astrocitarie a valle, fornendo un razionale terapeutico per prevenire o attenuare la disfunzione neurovascolare indotta da terapia CAR-T.

Immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome (ICANS) is a complication of chimeric antigen receptor (CAR)-T cell therapy. We investigated the cellular and molecular dynamics underlying CAR-T-related ICANS using an HSPC-humanized murine model that enables human CAR-T and tumor cell interactions within a reconstituted human immune system, and a fully human in vitro blood-brain barrier (BBB) model derived from iPSC-differentiated endothelial, mural, and astrocytic cells. About 50% of 19.28z CAR-T-treated mice developed multifocal brain-restricted haemorrhages. Magnetic resonance imaging revealed extravasation event, consistent with BBB leakage confirmed by Evans blue quantification in brain tissue. Impaired locomotor performance indicated functional neurovascular alterations. Similar to clinical observations, haemorrhagic lesions were more frequent in mice experiencing severe cytokine release syndrome, suggesting that CAR-T-induced inflammatory responses exacerbate BBB dysfunction and neurotoxic manifestations. High-resolution spatial transcriptomics using Xenium-5K technology mapped neuronal and non-neuronal populations across brain regions, revealing a coordinated BBB response to CAR-T therapy. Fibrous astrocytes Gfap⁺Serpina3n⁺ defined reactive niches linked to Pvalb⁺ GABAergic interneurons impairment leading to loss of functional brain connectivity and neuronal circuits hyperexcitability. Endothelial cells displayed downregulation of BBB-enriched programs regulating tube morphogenesis and cell- junction organization, indicating loss of CNS-specific endothelial identity and junctional destabilization. In the human in vitro BBB model, sera from CAR-T-treated patients with ICANS induced barrier disruption, reduced trans-endothelial electrical resistance, increased permeability and astrocyte activation compared to sera from patients without ICANS. A cocktail of small molecules designed to enhance barrier tightness restored endothelial function and reduced astrocyte activation in both preventive and therapeutic settings. The model also confirmed the lower neurotoxic potential of naïve/stem memory-enriched CAR-T cells versus effector-enriched products. Our results identify endothelial dysfunction as an upstream and actionable driver of neurovascular injury that amplifies glial activation and impairs inhibitory circuitry. Restoring endothelial integrity markedly attenuates downstream astrocytic responses, unveiling a potential therapeutic avenue to prevent or mitigate neurovascular dysfunction during CAR-T therapy.