In proximity to DNA polymerase λ: discovering novel interactors through the BioID approach And Revealing Ellagitannins as potent and selective SGK1 inhibitors for targeted therapy

La DNA polimerasi λ (Pol λ) fa parte della famiglia X delle DNA polimerasi. È un enzima specializzato coinvolto in vie classiche e alternative di riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA e nella sintesi translesione (TLS). L'identificazione di interattori di Pol λ pone una sfida significativa a causa delle interazioni transitorie che questo enzima instaura nei processi di riparazione/TLS e della mancanza di anticorpi specifici ed efficaci in analisi di immunofluorescenza (IF) e co-immunoprecipitazione (IP). Per affrontare questa sfida, abbiamo adottato un nuovo approccio di “biotinilazione dipendente dalla prossimità” (BioID) che sfrutta l'attività di una biotina ligasi mutante umanizzata derivata da A. aeolicus che biotinila in modo promiscuo le proteine con cui viene in contatto. Il costrutto BirA_Pol λ è stato generato e trasfettato in cellule U2OS. In questo modo, le proteine interagenti con Pol λ interagiscono anche con BirA, venendo così biotinilate. Le proteine biotinilate sono state raccolte con microsfere rivestite di streptavidina e identificate mediante analisi di spettrometria di massa. Abbiamo condotto questa analisi in cellule non perturbate e identificando nuovi interratori e confermando alcuni di quelli noti, provando così la solidità della tecnica impiegata. I fattori identificati sono coinvolti in replicazione e riparazione del DNA. Inaspettatamente, tra le nuove proteine identificate diverse risultano coinvolte nel metabolismo del nucleolo, suggerendo una localizzazione nucleolare Pol λ in cellule non perturbate da agenti che causa danni al DNA. Le protein-chinasi sono un gruppo di circa 500 proteine in grado di fosforilare residui specifici di tirosina, serina o treonina in proteine bersaglio. Queste reazioni costituiscono cascate di segnali che si propagano all’interno della cellula a seguito di stimoli esterni ed interni e determinano determinando la risposta cellulare. Di conseguenza, la loro deregolazione è causa di diverse patologie, inclusa la progressione tumorale. La chinasi 1 inducibile da siero e glucocorticoidi (SGK1) è una chinasi serina/treonina che svolge un ruolo in numerosi processi fisiologici e patologici. È sovraespressa in diversi tumori e la sua espressione è regolata in diversi modi nell'ipertensione, nella neuropatia diabetica, nell'ischemia e nelle malattie neurodegenerative. Dato il suo coinvolgimento in numerose malattie diverse, SGK1 rappresenta un promettente bersaglio per lo sviluppo di nuovi farmaci. L'analisi in silico ha identificato un pannello di potenziali inibitori di SGK1 e i test in vitro hanno confermato un composto appartenente alla classe degli ellagitannini come un promettente candidato per l'inibizione di SGK1 (EC50: 16,52 ± 2,08 nM). Gli ellagitannini sono dei costituenti chimici del melograno con attività antinfiammatoria che hanno dimostrato di esercitare effetti antitumorali su vari tipi di cellule tumorali. Data la loro origine e la loro facile reperibilità, queste molecole possono essere considerate farmaci molto promettenti per l'inibizione di SGK1. Lo sviluppo di test da condurre su cellule tumorali sarà la chiave per validare l’efficacia dei composti più promettenti in vivo.

DNA polymerase λ (Pol λ) is a specialised enzyme involved in different DNA repair pathways, including classical Non-Homologous End Joining (NHEJ) and alternative double-strand break repair pathways, as well as in faithful Translesion synthesis (TLS) over 8-oxo-dG. The identification of Pol λ interactors poses significant challenges due to its transient interactions within repair/TLS pathways and the lack of specific and effective antibodies for IF and co-IP. To address this challenge, we have adopted a proximity-dependent biotinylation (BioID) approach. This exploits the activity of a mutant A. aeolicus biotin ligase BirA, which promiscuously biotinylates proximity proteins. A BirA_Pol λ construct was expressed in U2OS cells and biotinylated proteins were collected using streptavidin-coated beads and identified by mass spectrometry. As expected, we identified both known and novel Pol λ interactors involved in DNA repair and replication processes, as well as in telomeres metabolism and Alternative Lengthening of Telomeres (ALT) process, confirming our previous finding. In unperturbed conditions, we also identified several Pol λ interactors involved in nucleolar metabolism. These interactions were lost upon etoposide and hydroxyurea (HU) treatment, suggesting Pol λ re-localization at the lesions upon damage. Distinct classes of enzymes are implicated in the initiation and progression of tumours. Kinases are involved in the onset and progression of many diseases, including cancer. Protein kinases play a pivotal role in cellular signalling under both physiological and pathological conditions. Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 (SGK1) is a serine/threonine kinase implicated in various biological processes and diseases. SGK1 is found overexpressed in several types of cancer and its expression is dysregulated in conditions such as hypertension, diabetic neuropathy, ischaemia, and neurodegenerative disorders. Given its involvement in multiple pathologies, SGK1 represents a promising target for drug development. Through in silico analyses, we have screened a panel of potential SGK1 inhibitors including several ellagitannins. These are polyphenolic compounds derived from pomegranate with known anti-inflammatory and anticancer properties. Among these compounds, we identified hits showing potency of inhibition in the nanomolar range and highly selectivity toward SGK1. The ability of these compounds to reach their molecular target within living cells was also confirmed using nanogels nanoparticle carriers to overcome cell membrane permeability issues. These active molecules represent a new class of highly potent and selective SGK1 inhibitors, providing a solid foundation for the development of next-generation analogues with superior potency and improved pharmacokinetic properties.