3D modelling of non-functioning pancreatic neuroendocrine tumors for functional studies and personalized medicine

Introduzione: I tumori neuroendocrini pancreatici (PanNET) non funzionanti (NF) continuano a rappresentare una rilevante sfida clinica in ragione della loro marcata eterogeneità biologica e della scarsità di strumenti predittivi affidabili per orientare la scelta terapeutica. Un limite centrale risiede nella mancanza di modelli preclinici in grado di riprodurre fedelmente sia le caratteristiche intrinseche del tumore sia il microambiente tumorale (TME), elemento cruciale nel modulare la progressione di malattia e la risposta ai trattamenti. Scopo di questo progetto è quello di esaminare le conseguenze cliniche di tali lacune, e di sviluppare modelli derivati da paziente, insieme a modelli biostampati, in grado di integrare componenti tumorali e TME al fine di fornire una piattaforma preclinica più completa per lo studio della biologia dei PanNET. Metodi: Studi clinici: analisi retrospettive su pazienti sottoposti a chirurgia curativa per PanNET non funzionanti presso l’Ospedale San Raffaele (HSR). 1) L’appropriatezza del trattamento chirurgico è stata classificata come appropriata, overtreatment o undertreatment, sulla base di caratteristiche istopatologiche e dell’eventuale recidiva di malattia. 2) L’insorgenza di diabete postoperatorio è stata valutata in pazienti sottoposti a pancreasectomia distale, analizzando dati clinici, laboratoristici e radiologici preoperatori. Studi preclinici: 3) generazione di tumoroidi (PDT) e sezioni tissutali (PCTS) da campioni crioconservati di NF-PanNET (HSR e Università di Berna). La sensibilità farmacologica a sunitinib, everolimus, temozolomide è stata quantificata e classificata. 4) sviluppo di modelli biostampati 3D utilizzando linee cellulari di PanNET, cellule endoteliali e stromali, incorporate in un biomateriale. Sono stati generati modelli semplici (mono-coltura) e complessi (co-coltura), mantenuti in condizioni statiche o dinamiche mediante un bioreattore home-made. Risultati: Studi clinici: 1) Un trattamento inadeguato è stato riscontrato nel 40% dei pazienti (34% overtreatment; 6% undertreatment), con il diametro tumorale quale unico predittore attualmente disponibile. 2) Quasi la metà dei pazienti sottoposti a chirurgia per malattia localizzata ha sviluppato diabete postoperatorio. È stato elaborato un nomogramma ed un calcolatore di rischio online, per stimare il rischio individuale. Studi preclinici: 3) I PDT hanno evidenziato una robusta concordanza con gli esiti clinici in risposta alla chemioterapia citotossica nei PanNET G1-G3, mentre hanno mostrato capacità predittiva limitata nei confronti dei farmaci a bersaglio molecolare (TT). Le colture ex vivo PCTS hanno preservato l’architettura tissutale, la citomorfologia endocrina, l’organizzazione vascolare e le componenti stromali e immunitarie, mantenendo la vitalità per almeno 10 giorni. I profili di risposta farmacologica alle TT nei PCTS si sono discostati da quelli dei PDT, evidenziando l’influenza determinante del microambiente nella modulazione della sensibilità terapeutica. 4) Sono stati sviluppati costrutti biostampati in grado di supportatare la vitalità cellulare e le interazioni omo- ed eterotipiche. Sono state generate strutture simil-vascolari circondate dal compartimento tumorale, mantenute in perfusione. i costrutti hanno preservato le differenze fenotipiche intrinseche delle diverse linee cellulari di PanNET. Conclusioni: I risultati clinici evidenziano la necessità di criteri biologicamente informati per ottimizzare le decisioni terapeutiche nei pazienti affetti da NF-PanNET. Questo lavoro propone un insieme di modelli preclinici complementari, PDT, PCTS e costrutti biostampati, che, nel loro complesso, ricapitolano le dimensioni intrinseche e microambientali della biologia dei PanNET e rappresentano piattaforme promettenti per test farmacologici personalizzati e studi meccanicistici.

ntroduction: Pancreatic neuroendocrine tumours (PanNETs) pose persistent therapeutic challenges due to their marked biological heterogeneity and the limited availability of predictive tools to guide treatment selection. A central barrier is the absence of preclinical models that reliably recapitulate both tumour-intrinsic features and the tumour microenvironment (TME), the latter being a critical determinant of disease progression and therapeutic response. This project examined the clinical implications of these gaps and sought to develop complementary patient-derived and 3D bioprinted models that integrate tumour and microenvironmental components, providing a more comprehensive preclinical framework for the study of PanNET biology. Methods: Clinical studies: Retrospective studies were conducted on patients who underwent curative surgery for nonfunctioning (NF)-PanNETs at San Raffaele Hospital (HSR). 1) The appropriateness of surgical treatment was categorized as appropriate, overtreatment, and undertreatment based on histopathological features and disease relapse. 2) Postoperative diabetes development was evaluated in patients submitted to distal pancreatectomy. Preoperative clinical, laboratory and radiological data were assessed. Preclinical studies: 3) Patient-derived tumoroids (PDTs) and slices (PCTS) were generated from cryopreserved NF-PanNET specimens from surgically resected patients (HSR and University of Bern); drug sensitivity (sunitinib, everolimus, temozolomide) was quantified and categorized. 4 ) 3D bioprinted models were generated using PanNET cell lines and endothelial and stromal cells, embedded in a hydrogel-based bioink. Both simple (mono-culture) and complex (co-culture) models were generated and cultured under static or dynamic conditions using a bioreactor printed in house. Results: Clinical studies: 1) Inadequate treatment was observed in 40% of patients (34% overtreatment, 6% undertreatment), with tumour diameter emerging as the only currently available predictor. 2) Nearly half of the patients undergoing surgery for localized disease developed postoperative diabetes. A nomogram and online risk calculator were developed to estimate individual risk. Preclinical studies: 3) PDTs demonstrated robust concordance with clinical outcomes for cytotoxic chemotherapy across G1–G3 PanNETs, but limited predictive value for targeted agents. In contrast, PCTSs preserved tissue architecture, endocrine cytomorphology, vascular structures, and stromal/immune elements, maintaining viability for at least 10 days ex vivo. Drug testing in PCTSs revealed response profiles that diverged from those of PDTs, underscoring the contribution of microenvironmental cues to therapeutic sensitivity. 4) 3D bioprinted constructs were successfully generated, supporting viability and homo-/hetero-typic cellular interactions. Vessel-like structures enclosed by tumour compartment were generated and perfusion was maintained into a bioreactor. Tumour cell behaviour within these constructs recapitulated intrinsic phenotypic differences observed across PanNET cell lines. Conclusions: The clinical findings underscore the need for biologically informed criteria to guide treatment decisions and avoid unnecessary long-term sequelae in this often indolent disease. To address this gap, this work present a set of complementary preclinical models, PDTs, PCTSs, and 3D bioprinted constructs, that together capture tumour- intrinsic and microenvironmental dimensions of PanNET biology, providing promising platforms for personalised drug testing and mechanistic studies on PanNET biology.