Studi in vitro dell'eritropoiesi umana tramite l'uso di modelli tridimensionali di midollo osseo di seta in grado di generare isole eritroblastiche

The effort to produce ex vivo erythrocytes has led to the development of in vitro culture systems able to mimic bone marrow niche key features. In particular, a three-step protocol (expansion, erythroid differentiation, maturation/enucleation) is widely used, and it is characterized by a specific cytokine cocktail that varies according to cellular source and experimental design. Moreover, most of these protocols rely on bioreactors known as “stirred-tank”, roller bottles, and G-Rex gas-permeable membranes. However, they often fail to accurately reproduce bone marrow complex dynamics; furthermore, they show a high technical complexity with restricted scalability. In this study, we employ a comprehensive approach focused on hematopoietic stem cells differentiation towards red blood cells with a minimal cytokine regimen without concentration changes throughout the culture duration. A significant advancement in our method is the use of a three-dimensional (3D) silk-based scaffold, engineered to replicate both the physical and chemical characteristics of human bone marrow. Scaffold’s porosity and its functionalization with matrix protein, such as fibronectin, allow cellular distribution in configurations similar to those observed in vivo, known as erythroblastic islands (EBIs), with the presence of a central macrophage surrounded by maturing erythroblasts. Fibronectin (FN) plays a key role in the system because erythroblasts express α4β1 integrin, which mediates not only FN adhesion, thereby promoting the correct anchorage to the matrix, but also V-CAM1 interaction, expressed by macrophages. Therefore, our 3D model can support in vitro erythroblastic niche development, supplying a structure and microenvironment comparable to those of the bone marrow. Within these niches, we observed multiple stages of erythroblast maturation, thus suggesting that EBI could ensure a continuous reservoir of maturing cells. Moreover, RNA sequencing analyses show upregulated genes in 3D niches with respect to the bidimensional culture; the pathways related to these genes involve physiological processes activated during erythroid maturation, such as autophagy, endocytosis, and lysosomal activity. Membrane remodeling, intracellular organelle and surface proteins clearance, such as receptors and integrins, are driven by the formation of endosomes, multivesicular bodies, and autophagy activation. During maturation, erythroblasts progressively lose α4β1 integrin expression, with a consequent loss of adhesion to the scaffold. Within the bioreactor, such a reduction of adhesion allows mature erythrocytes to be released; medium culture dynamic perfusion facilitates their detachment and collection in perfusion bags. Finally, autophagy pharmacological inhibition, in the 3D silk system, revealed its role in the erythroid niche; autophagy blockade disrupts EBI formation and erythroblast clustering, holding them in an immature stage. Our results highlight the crucial role of the silk bone marrow model in preserving the structural integrity of EBIs and emphasize autophagy’s key function in organelle clearance during RBC maturation. Therefore, our 3D bone marrow model combines a simplified culture protocol with the possibility to faithfully replicate those dynamics behind erythroid differentiation, showing its potential as an optimized 3D system to enhance the study and understanding of the main mechanisms of blood cell production.

Il tentativo di produrre eritrociti ex vivo ha condotto allo sviluppo di sistemi di coltura in vitro progettati per mimare le caratteristiche chiave della nicchia midollare. In particolare, è ampiamente adottato un protocollo a tre stadi (espansione, differenziazione eritroide, maturazione/enucleazione), in cui ogni fase richiede un cocktail di citochine specifico, che varia in base alla fonte cellulare e all’assetto sperimentale. Nonostante l’uso diffuso di bioreattori stirred-tank, bottiglie rotanti e sistemi G-Rex, questi modelli non riproducono fedelmente la complessità della nicchia ematopoietica e presentano una notevole complicatezza tecnica che ne ostacola la scalabilità. In questo studio viene impiegato un approccio integrato, focalizzato sul differenziamento delle cellule staminali ematopoietiche in globuli rossi, mediante un protocollo di coltura che prevede l’impiego di citochine essenziali per il differenziamento eritroide a concentrazione invariata per tutta la durata della coltura. Un importante progresso in tal metodo è l’impiego di uno scaffold tridimensionale a base di seta, progettato per mimare sia le caratteristiche fisiche che chimiche del midollo osseo umano. La porosità dello scaffold e la sua funzionalizzazione con proteine della matrice extracellulare, quali la fibronectina, infatti, permettono l’organizzazione delle cellule in configurazioni simili a quelle osservate in vivo, descritte come isole eritroblastiche, caratterizzate dalla presenza di un macrofago circondato da eritroblasti in fase di maturazione. La fibronectina svolge un ruolo chiave nel sistema in quanto gli eritroblasti esprimono l’integrina α4β1, che media non solo l’adesione ad essa, promuovendo quindi il corretto ancoraggio alla matrice, ma anche l’interazione con V-CAM 1 espresso dai macrofagi. All’interno di queste nicchie sono stati osservati diversi stadi di maturazione degli eritroblasti, ad indicare che l'isola eritroblastica possa garantire un continuo reservoir di cellule in fase di maturazione. Inoltre, analisi di sequenziamento di RNA hanno mostrato la presenza di geni upregolati nella nicchia 3D rispetto alla coltura bidimensionale; i pathway correlati a questi geni riguardano processi fisiologici attivati durante la maturazione eritroide quali autofagia, endocitosi e attività lisosomiale. Il rimodellamento della membrana, la clearance degli organelli intracellulari e delle proteine di superficie, come recettori e integrine, sono guidati dalla formazione di endosomi, corpi multivescicolari e autofagia. Durante la maturazione gli eritroblasti riducono progressivamente l’espressione dell’integrina α4β1, con conseguente perdita di aderenza allo scaffold. Nel bioreattore, questa riduzione dell’adesione consente il rilascio degli eritrociti maturi; il flusso del mezzo di coltura in perfusione dinamica ne facilita il distacco e la raccolta in sacche per trasfusione. Infine, l’inibizione farmacologica dell’autofagia, nel modello tridimensionale di seta, ha consentito di evidenziare il ruolo di questo processo nella nicchia eritroide: il blocco dell’autofagia, infatti, compromette la formazione delle isole eritroblastiche e la disposizione in cluster degli eritroblasti, trattenendoli in uno stadio ancora immaturo. I risultati ottenuti evidenziano dunque il ruolo cruciale del modello midollare a base di seta nel preservare l’integrità strutturale delle isole eritroblastiche e sottolineano la funzione chiave dell’autofagia nella rimozione degli organelli durante la maturazione dei globuli rossi. Tale sistema tridimensionale unisce alla semplicità del protocollo di coltura la possibilità di ricreare fedelmente i meccanismi alla base del differenziamento eritroide, evidenziando il suo potenziale come sistema tridimensionale ottimizzato per lo studio dei meccanismi che regolano la produzione delle cellule del sangue.