Dissecting and targeting Purkinje cells-calcium deregulation in Autosomal Recessive Spastic Ataxia of Charlevoix-Saguenay (ARSACS)

ARSACS è una malattia neurodegenerativa progressiva caratterizzata da atassia cerebellare infantile, seguita da spasticità e neuropatia periferica. È causata da oltre 200 mutazioni da perdita di funzione nel gene SACS, codificante sacsina, una proteina multimodulare di ~520 kDa espressa soprattutto nel sistema nervoso centrale e particolarmente abbondante nelle cellule di Purkinje (PC). Il principale segno neuropatologico di ARSACS è la progressiva degenerazione delle PC, osservata nei pazienti e nel modello murino Sacs-/-, che riproduce la malattia umana. La funzione fisiologica di sacsina rimane sconosciuta e i meccanismi alla base della degenerazione delle PC in ARSACS sono ancora poco compresi. L'aggregazione dei neurofilamenti (NF) è uno dei primi eventi patologici in ARSACS. Modelli cellulari della malattia hanno evidenziato alterazioni nella morfologia e nel metabolismo mitocondriale. Mediante immunofluorescenza ed imaging in vivo, nelle colture cerebellari primarie abbiamo identificato un difetto nel traffico degli organelli verso la periferia, secondario all’aggregazione dei NF e responsabile della compromissione dell’omeostasi del calcio. A sostegno del ruolo del calcio nella patogenesi, abbiamo osservato livelli alterati della subunità ausiliaria α2δ2 del canale del calcio Cav2.1 e di proteine sinaptiche. Tramite frazionamento subcellulare, abbiamo inoltre rilevato un arricchimento di sacsina nella frazione della membrana cerebellare, specialmente nella densità post-sinaptica, insieme a livelli aumentati del Cav2.1 nelle membrane Sacs-/- già in fase pre-sintomatica. Coerentemente, abbiamo riscontrato un aumento delle correnti di calcio mediate dal Cav2.1 ed una riduzione del firing spontaneo delle PC Sacs-/-, potenziale causa dell’atassia nei pazienti. Utilizzando un modello computazionale di PC, abbiamo dimostrato che questo deficit nel firing è causato dal KCa2.2, un membro della famiglia dei canali del potassio calcio-dipendenti (SK), in risposta all'aumento delle correnti di calcio. Come ulteriore prova del legame tra sacsina e il Cav2.1, abbiamo trovato sacsina arricchita nel nanoambiente del canale e capace di interagire con α2δ2. Questi risultati hanno fornito il razionale per sviluppare una strategia di screening ad alto rendimento in tre stadi volta all’identificazione di composti in grado di inibire specificatamente il Cav2.1. Complessivamente, questa tesi fornisce nuove conoscenze sulla patogenesi di ARSACS e apre nuove prospettive per future terapie.

ARSACS is a progressive neurodegenerative disease characterized by a childhood-onset cerebellar ataxia followed by spasticity and peripheral neuropathy. It is caused by more than 200 different loss of function mutations in the SACS gene, which encodes sacsin, a ~520 kDa multimodular protein mainly expressed in the central nervous system (CNS) and particularly abundant in Purkinje cells (PCs) in the cerebellum. The most prominent neuropathological hallmark of ARSACS is the progressive PC degeneration, observed in patients and in the Sacs-/- mouse model, which recapitulates the human disease. To date, the physiological function of sacsin remains unknown, and the molecular mechanisms underlying PC dysfunction and degeneration in ARSACS are still poorly understood. Neurofilament (NF) bundling represents one of the earliest pathological events in ARSACS. In cellular models of the disease, alterations in mitochondrial morphology and metabolism have also been reported. By immunofluorescence and live imaging experiments, we disclosed faulty organellar trafficking to the periphery as secondary to NF bundling in primary cerebellar Sacs-/- PC cultures, ultimately leading to impaired calcium homeostasis. To further support the critical role of calcium dysregulation in ARSACS pathogenesis, we found altered levels of the Voltage-Gated Calcium Channel (VGCC) Cav2.1 auxiliary subunit α2δ2 and of synaptic proteins. Consistently, by subcellular fractionation of the mouse cerebellum, we found sacsin enriched at the cerebellar membrane fraction, especially at the post-synaptic density. Moreover, we disclosed increased levels of the Cav2.1 at the Sacs-/- membranes at pre-symptomatic stages. In agreement, at the same time points, we found enhanced Cav2.1-mediated calcium currents and reduced spontaneous firing in Sacs-/- PCs, which in turn might trigger ataxia in ARSACS. Using a PC computational model, we demonstrated that this firing deficit is caused by KCa2.2, a member of the calcium-dependent potassium (SK) channel family, in response to increased Cav2.1 calcium currents. As further evidence of the link between sacsin and Cav2.1, we found sacsin belonging to the channel nano-environment and interacting with α2δ2. The collected evidence provided the basis for performing a three-stage high-throughput strategy to identify compounds that specifically target Cav2.1. Overall, this thesis provides new insights into ARSACS pathogenesis and opens new perspectives for therapy.