Detection of micro-imbalances in single fetal trophoblasts isolated from maternal blood for prenatal testing

Recent technological improvements have created unprecedented opportunities for non-invasive prenatal testing (NIPT). Currently, the most commonly adopted non-invasive prenatal testing framework is cell-free DNA (cfDNA) analysis. This test allows to reliably detect common aneuploidies as well as sub-chromosomal copy number variants (CNVs) larger than 7 Mbps, in addition to a limited set of selected smaller CNVs that are specifically targeted. Although these cfDNA tests reached high performances in terms of sensitivity and specificity, the low-resolution still represents a major limitation to reliably detect pathogenic imbalances below 7Mb on a genomic level. In recent years, Menarini Group developed a cell-based non-invasive prenatal testing (CB-NIPT) workflow for the isolation of single circulating extra villous trophoblasts (cEVTs) from maternal blood draw. The possibility to analyse intact, single fetal cells offers unprecedented opportunities to investigate in detail the genomic asset of the fetus, even potentially highlighting aberrations private to individual cells or small subsets of them. Moreover, this analysis also isolates the fetal genetic material from the maternal one, removing one of the major complications entailed in cfDNA analyses, and allowing to achieve higher resolution in sub-microscopic imbalances detection. Additionally, given their abundance in maternal circulation during early gestation (<11 gw), cEVTs offer a valuable opportunity for CB-NIPT to tackle the currently unmet clinical need for sub-microscopic CNVs early screening, increasing the therapeutic options clinically available for the patient. This thesis work was focused on the improvement of the existing bioinformatics pipeline part of Menarini CB-NIPT protocol. In particular, I focused on implementing a signal normalization strategy to reduce the background noise in the copy number signals computed by our pipeline, removing existing systematic biases and therefore reducing the number of low quality chromosomal abnormality calls, improving the reliability of our results and increasing our protocol’s resolution for sub-microscopic CNVs detection. In parallel, I also explored strategies to improve the consistency and reliability of our automated fetal sex inference algorithm, trying to minimize the need for manual curation of our results thus simplifying the aggregation of analysis results obtained from multiple isolated cells belonging to the same fetus.

I miglioramenti tecnologici dei più recenti anni hanno creato delle opportunità finora inedite nell’ambito dello screening prenatale non invasivo (NIPT). Attualmente, la metodologia più comunemente adottata per questa tipologia di screening è l’analisi del cell-free DNA (cfDNA). Questa analisi consente di identificare accuratamente le aneuploidie più comuni, così come alterazioni sub-cromosomiche, quali variazioni del numero di copie (CNVs) di dimensione superiore a 7 Mbps, in aggiunta ad un ristretto gruppo di CNVs selezionate al di sotto di questa dimensione, che vengono investigate in maniera specifica. Nonostante il fatto che questi cfDNA test raggiungano ottime prestazioni in termini di sensibilità e specificità, la loro limitata risoluzione rappresenta tuttora un grande limite per l’identificazione attendibile, ed a livello genomico, di sbilanciamenti cromosomici patogenici e di dimensione inferiore alle 7 Mbps. Recentemente, il Gruppo Menarini ha sviluppato un flusso sperimentale per il cell-based NIPT (CB-NIPT), finalizzato all’isolamento di singoli trofoblasti extravillari circolanti (cEVTs) a partire da un prelievo di sangue materno. La possibilità di analizzare singole cellule fetali integre offre opportunità senza precedenti per investigare nel dettaglio la costituzione genomica del feto, con la potenzialità di evidenziare particolari aberrazioni che risultano esclusive di singole cellule, o di gruppi molto ristretti di esse. Inoltre, questa analisi isola il materiale genetico del feto da quello della madre, rimuovendo una delle maggiori sorgenti di ‘rumore’ associata alle analisi di cfDNA, e permettendo quindi di ottenere una migliore risoluzione nell’identificazione di sbilanciamenti sub-microscopici. Per di più, data la loro abbondanza nel circolo sanguigno materno durante le prime fasi della gravidanza (<11 settimane di gestazione), l’analisi dei cEVTs offre un’opportunità per il CB-NIPT di far fronte ad un bisogno clinico attualmente non soddisfatto, ovvero lo screening precoce delle CNVs sub-microscopiche, aumentando quindi le opzioni terapeutiche disponibili a livello clinico per le pazienti. Questo lavoro di tesi è stato incentrato sul miglioramento della preesistente pipeline di analisi bioinformatica che è parte del protocollo CB-NIPT sviluppato dal Gruppo Menarini. Nello specifico, mi sono concentrato sull’implementazione di una strategia di normalizzazione del segnale, volta a ridurre il livello di rumore di sottofondo nei segnali di copy-number calcolati tramite la nostra pipeline, per ridurre i bias sistematici esistenti e, di conseguenza, il numero di chiamate di anormalità cromosomiche di bassa qualità, migliorando quindi l’affidabilità dei nostri risultati e la risoluzione del protocollo CB-NIPT per l’identificazione delle CNVs sub-microscopiche. Parallelamente, ho anche esplorato strategie computazionali per migliorare la robustezza e accuratezza del nostro algoritmo per l’inferenza automatica del sesso fetale, tentando di minimizzare la necessità di revisione manuale delle previsioni, dunque semplificando l’aggregazione dei risultati di analisi ottenuti da multiple cellule isolate per lo stesso feto.