Deciphering the tumor-immune microenvironment and reprogramming tumor-infiltrating lymphocytes for glioblastoma T cell therapy

During my PhD, I investigated how the immune system can be harnessed to treat glioblastoma, one of the most aggressive brain tumors. Tumor progression in glioblastoma is driven more by the tumor microenvironment (TME) than by genetic alterations, making the understanding of immune interactions critical for therapy. In our study, we collected tumor samples from 161 patients and successfully expanded TILs from more than half of them. We discovered that a marker called CD137 identifies the most tumor-reactive T cells, which showed strong antitumor activity in laboratory experiments and animal models. Some patients’ TILs were harder to grow due to IDH1 mutation or steroid treatment, thereby defining key exclusion criteria for the upcoming clinical trial, ReacTIL. To explore the mechanisms underlying TIL expandability, we performed single-cell RNA sequencing on tr-TIL samples and matched immune microenvironment, constructing a comprehensive glioblastoma single-cell atlas. The TME composition strongly influenced TIL fate: enrichment in monocytes and neutrophils created an immunosuppressive niche limiting expansion, whereas macrophages, dendritic cells, and endothelial cells fostered a more permissive environment. Peripheral biomarkers, such as higher neutrophil counts, correlated with poor TIL expandability, suggesting a potential simple tool for patient stratification. The presence of progenitor-like T cells within these samples indicated that targeted reprogramming could restore their expansion potential. We tested cytokine-based strategies to enhance TIL function: IL-33 robustly expanded TILs with progenitor and memory features. These reprogrammed TILs maintained both glycolysis and oxidative phosphorylation at low activation levels, preventing terminal exhaustion and enabling sustained, efficient anti-tumor responses. Low-dose IL-2 partially reinvigorated exhausted TILs and revealed distinct molecular subtypes, although some terminally exhausted TILs remained refractory to reprogramming, likely due to durable epigenetic modifications from chronic tumor exposure. Overall, this work highlights how the glioblastoma microenvironment shapes TIL function and demonstrates strategies to enhance tumor-reactive T cells for therapy. By combining insights into immune suppression with optimized TIL expansion and reprogramming, it provides a roadmap for personalizing adoptive cell therapies, paving the way for future clinical trials and next-generation immunotherapies.

Durante il mio dottorato, ho studiato come il sistema immunitario possa essere utilizzato per trattare il glioblastoma, uno dei tumori cerebrali più aggressivi. La progressione del glioblastoma è guidata più dal microambiente tumorale (TME) che dalle alterazioni genetiche, rendendo fondamentale la comprensione delle interazioni immunitarie ai fini terapeutici. Nel nostro studio, abbiamo raccolto campioni tumorali da 161 pazienti e siamo riusciti ad espandere i linfociti infiltranti il tumore (TIL) nel 50% dei casi. Abbiamo scoperto che un marcatore chiamato CD137 identifica le cellule T reattive contro il tumore, le quali hanno mostrato una forte attività antitumorale in esperimenti di laboratorio e modelli animali. In alcuni pazienti, i TIL risultavano più difficili da espandere a causa della mutazione di IDH1 o di trattamenti con steroidi, definendo così importanti criteri di esclusione per il prossimo studio clinico, ReacTIL. Per esplorare i meccanismi alla base della capacità di espansione dei TIL, abbiamo eseguito RNA-sequencing a singola cellula su campioni di tr-TIL e microambienti immunitari corrispondenti, costruendo un completo atlante a singola cellula del glioblastoma. La composizione del TME influenzava fortemente il destino dei TIL: l’arricchimento in monociti e neutrofili creava una nicchia immunosoppressiva che limitava l’espansione, mentre macrofagi, cellule dendritiche e cellule endoteliali favorivano un ambiente più permissivo. Biomarcatori periferici, come conteggi elevati di neutrofili, correlavano con una scarsa espandibilità dei TIL, suggerendo un potenziale strumento semplice per la stratificazione dei pazienti. La presenza di cellule T con caratteristiche progenitor in questi campioni indicava che una riprogrammazione mirata potrebbe ripristinare il loro potenziale di espansione. Abbiamo testato strategie basate su citochine per potenziare la funzione dei TIL: l’interleuchina 33 ha promosso in modo robusto l’espansione di TIL con caratteristiche progenitor e di memoria. I TIL riprogrammati mantenevano sia la glicolisi sia la fosforilazione ossidativa a bassi livelli, prevenendo l’exhaustion terminale e consentendo risposte antitumorali sostenute ed efficienti. L’IL-2 a basse dosi ha parzialmente rivitalizzato i TIL exhausted e rivelato sottotipi molecolari distinti, sebbene alcuni TIL terminalmente exhausted siano rimasti refrattari alla riprogrammazione, probabilmente a causa di modifiche epigenetiche durature dovute all’esposizione cronica al tumore. Nel complesso, questo lavoro evidenzia come il microambiente del glioblastoma plasmi la funzione dei TIL e dimostra strategie per potenziare le cellule T reattive contro il tumore a fini terapeutici. Combinando le conoscenze sui meccanismi di immunosoppressione con protocolli ottimizzati di espansione e riprogrammazione dei TIL, lo studio traccia una mappa per la personalizzazione delle terapie cellulari adottive, aprendo la strada a futuri trial clinici e a immunoterapie di nuova generazione.