Development of a Microbiologically Activated Biochar Toolbox for the Enhancement of Bioremediation Processes

Soil is considered a non-renewable resource and contamination stands as a primary driver of its degradation and consumption. The continued reliance on petroleum hydrocarbon for industrial activities creates a significant environmental risk. The use, production and transport of petroleum hydrocarbons frequently result in their release into the environment, making the remediation of contaminated soil an environmental challenge. Bioremediation is an efficient, sustainable and cost-effective alternative for the bioremediation of hydrocarbon contaminated soils. This technique exploits the metabolic abilities of microorganisms to transform or mineralize contaminants. Bioremediation can be applied through two different strategies, which are Biostimulation and Bioaugmentation. The latter involves the addition of exogenous microorganisms in the form of bacterial strains or consortia to increase genetic diversity in the polluted matrix. Bioaugmentation still shows limitations since inoculated microbial strains need to find a niche to establish and colonize. In fact, they must compete with the autochthonous soil microbial community and they need to overcome abiotic stresses in the new matrix. This limitation can be addressed using a carrier on which microbial strains could be immobilized. This carrier needs to be environmentally compatible, stable and its production needs to be economically sustainable. Moreover, it should have enough surface area to host microorganisms, facilitating their interaction with the target contaminants. Biochar, a carbonaceous solid produced through pyrolysis, could be a valid candidate for microbial immobilization. In fact, its porous structure can offer a shelter for inoculated microorganisms in which they can grow and reproduce. In this perspective, the aim of this PhD research was the production, conservation, application and monitoring of Microbial activated Biochar (MaB) in Bioremediation and Phyto(rhizo)remediation interventions. This objective was achieved through the design and validation of a workflow based on a sequential approach. The process began through the isolation of 24 microbial strains and the characterization of their hydrocarbonoclastic and plant growth promoting traits. The surface properties of the most promising microbial strains were analysed to choose two model strains, one hydrophobic and one hydrophilic, to study their affinity to different types of biochar. Physico-chemical characteristics of each batch of biochar produced were analysed to evaluate their suitability as microbial carriers to use in bioremediation interventions. Based on their optimal physicochemical characteristics and affinity for the two model strains, two carriers were identified: Ricinus communis pyrolyzed at 600 ̊ C and Brassica juncea pyrolyzed at 400 ̊ C, respectively for hydrophobic and hydrophilic strains. These biochar types were, initially, used to investigate optimal colonization and preservation conditions to ensure an adequate shelf-life for the Microbial activated Biochar. After incubation of biochar with the microbial biomass resuspended considering two different volumes, 108 CFU/g of biochar were retrieved on the carrier, indicating successful colonization in both conditions. Preservation was optimized through the study of Air-drying or Freeze-drying influence on the viability of immobilized bacterial cells and investigating storage temperature. The effectiveness of the Microbial-Activated Biochar was tested alongside Phytoremediation in laboratory and field experiments. This was done by comparing its performance to the single use of Biochar and the Inoculum added as free cells. Furthermore, a strategy, based on strain specific primers, was developed to monitor and quantify the presence of inoculated microorganisms in the treated matrix.

Il suolo è considerato una risorsa non rinnovabile e la contaminazione ambientale è uno dei maggiori fattori che porta al suo consumo e alla sua degradazione. La continua dipendenza delle attività industriali dall’uso degli idrocarburi petroliferi crea un rischio ambientale. Infatti, il loro uso e trasporto porta al loro rilascio in ambiente. Il Biorisanamento è un’alternativa efficiente e sostenibile per il rimedio di suoli contaminati da idrocarburi. Questa tecnica sfrutta il potenziale catabolico dei microrganismi nei confronti degli idrocarburi. Il Biorisanamento si attua attraverso due tecnologie che sono la Biostimolazione e il Bioaumento. Quest’ultimo considera l’addizione di ceppi o consorzi microbici per aumentare il potenziale genetico nella matrice contaminata. Il Bioaumento continua ad avere dei limiti, dal momento che le specie inoculate devono trovare una nicchia nel nuovo ambiente dove stabilirsi. Tuttavia, devono competere con le comunità microbiche indigene e affrontare le condizioni ambientali della nuova matrice. Questo limite può essere superato dall’immobilizzazione dei ceppi inoculati su un carrier, che però deve essere compatibile dal punto di vista ambientale, stabile ed economicamente sostenibile. In più, il carrier deve avere un’area superficiale abbastanza estesa da permettere la colonizzazione batterica e il contatto dei ceppi con il contaminante. Il Biochar, un substrato solido, ricco di carbonio e prodotto tramite pirolisi, può rivelarsi come una soluzione ottimale. Infatti, la sua struttura porosa può offrire uno spazio protettivo ai ceppi batterici da inoculare. In quest’ottica, l’obiettivo di questo progetto di dottorato è stata la produzione, la conservazione, l’uso e il monitoraggio di un biochar funzionalizzato microbiologicamente da utilizzare in interventi di biorisanamento di suoli contaminati da idrocarburi. Questo obiettivo è stato perseguito tramite la progettazione e l’applicazione di un workflow. Il processo è cominciato tramite l’isolamento di 24 ceppi batterici e la caratterizzazione delle loro capacità idrocarburoclastiche e di promozione della crescita vegetale. L’idrofobicità dei ceppi più promettenti è stata investigata con l’individuazione di due ceppi modello, uno idrofobico e uno idrofilico, la cui affinità e adesione al biochar è stata valutata nei confronti di campioni di carrier preparati da biomasse diverse e a diverse temperature di pirolisi. I biochar prodotti sono stati caratterizzati dal punto di vista chimico-fisico e considerando i risultati di caratterizzazione e adesione dei ceppi batterici sono stati individuati due biochar, Brassica juncea pirolizzata a 400°C e Ricinus communis pirolizzato a 600°C per immobilizzare rispettivamente il ceppo idrofilico e quello idrofobico. Due diversi volumi di colonizzazione sono stati testati ed inoltre sono state ottimizzate le condizioni per conservare il biochar inoculato tramite la valutazione di diversi trattamenti, come asciugatura all’aria e liofilizzazione e il mantenimento a diverse temperature per un periodo di tempo pari a 180 giorni. L’efficacia del Biochar funzionalizzato microbiologicamente è stata valutata a scala di laboratorio e a scala di campo tramite l’applicazione del Fitorimedio ed è stata comparata con l’efficacia del trattamento di biochar, inoculo e piante e le combinazioni di questi trattamenti. Il biochar attivato microbiologicamente non è sembrato essere la soluzione ottimale per il trattamento dei suoli utilizzati, dal momento che la biodiversità microbica osservata era elevata già dall’inizio del trattamento e le comunità batteriche erano già selezionate per le loro capacità di degradazione dei contaminanti.