Development of a tool for the genetic identification of circulating fetal trophoblasts and its applications

In recent years, cell-free DNA (cfDNA) analysis has become the gold standard for non-invasive prenatal testing. However, this method has limitations due to the fragmented and incomplete nature of the DNA template. Recently, the Menarini Group developed a non-invasive, cell-based method to isolate and genetically characterize fetal circulating extra-villous trophoblasts (cEVTs) from the mother's bloodstream. This new method offers the possibility of obtaining more comprehensive and clinically useful genomic information while also avoiding incidental maternal findings. Confirming the fetal origin of the isolated cells is still a necessary step. This is typically done using Short Tandem Repeat (STR) analysis, which compares maternal and fetal DNA. However, this method is time-consuming and resource-intensive and it also requires whole genome amplification to amplify the DNA template, which is a step that can introduce artifacts and lead to the loss of amplification for STR loci with large fragment sizes. Moreover, the application of STR analysis requires the split of the sample in two aliquots, one used for the STR assay itself, and the other one for the sequencing analysis, and this process can be error-prone. To overcome these limitations, we developed an automated in-silico tool for discriminating between fetal and maternal cells without the need for additional tests. The purpose of this study is to improve the existing method of fetal cell identification, thereby reducing time and improving resource management. Our tool aims to accurately identify different conditions such as dizygotic twins, molar pregnancies, and in vitro fertilizations (IVFs). We acknowledge some current limitations, such as the inability to detect certain cases of molar pregnancies because of their biparental origin. We are actively working on future improvements to address this last specific case.

Negli ultimi anni, l’analisi cell-free DNA (cfDNA) è diventata il gold standard nel campo dei test prenatali non invasivi. Tuttavia questo metodo ha delle limitazioni dovute alla natura frammentata ed incompleta del DNA templato utilizzato per l’analisi. Recentemente, il gruppo Menarini ha sviluppato un metodo non invasivo basato su singole cellule, al fine di isolare e caratterizzare geneticamente i trofoblasti fetali extra villari (cEVTs) dal sangue materno. Questa nuova metodologia offre la possibilità di ottenere un’informazione genomica più completa e geneticamente utile, insieme alla capacità di evitare potenziali incidental findings materni. La conferma dell’origine fetale delle singole cellule isolate rimane comunque un punto necessario in questa analisi. Tipicamente la tecnologia utilizzata a tal fine è basata sull’analisi di Short Tandem repeats (STR), confrontando il DNA fetale con quello materno. Tuttavia questo metodo è time-consuming e necessita di molte risorse, e inoltre richiede il passaggio attraverso tecniche di amplificazione dell’intero genoma che possono introdurre artefatti e portare alla perdita di amplificazione di loci STR situati su frammenti di dimensioni maggiori. In aggiunta, l’applicazione dell’analisi STR richiede che il campione venga splittato in due aliquote, una utilizzata appunto per il saggio STR, e l’altra per analisi di sequenziamento, un processo che può portare ad errori. Al fine di sorpassare tutti questi limiti, abbiamo sviluppato un tool automatico in-silico per la discriminazione dell’origine materna o fetale delle cellule, senza la necessità di ricorrere a test ulteriori. Lo scopo di questa ricerca è migliorare il metodo di identificazione delle cellule fetali preesistente, portando conseguenti miglioramenti anche in termini di tempi di analisi. Il nostro tool riesce inoltre a identificare diverse condizioni come la presenza di gemelli eterozigoti, gravidanze molari e fertilizzazioni in vitro (IVFs). Anche se siamo consci di alcuni limiti, come l’incapacità di identificare alcuni casi di gravidanze molari a causa della loro natura biparentale, stiamo lavorando attivamente su miglioramenti futuri per migliorare la sensibilità anche su queste casistiche.