Exploitation of probiotic strains with targeting cholesterol reduction for the formulation of functional foods [Sviluppo di ceppi probiotici con capacità di riduzione del colesterolo per la formulazione di alimenti funzionali]

The bile salt hydrolase (BSH) activity has emerged as a key probiotic trait linking gut microbiota functionality with host lipid metabolism and cardiovascular health. BSH is an enzyme which catalyzed the deconjugation of bile acids (BAs), which play a pivotal role in maintenance of host cholesterol homeostasis. Lactobacillus species are widely acknowledged as central BSH-active probiotics, by enhancing gastrointestinal strain survivability, as well as contributing to cholesterol-lowering activity. This thesis investigated the genomic, phenotypic, and functional properties of three BSH-positive candidates, Lacticaseibacillus rhamnosus VB1, Lacticaseibacillus rhamnosus VB4, and Levilactobacillus brevis M3R3, from human and food sources. Probiogenomic and phenotypic analyses revealed strain-specific genetic features related to BAs tolerance and deconjugation capacity in all the three investigated strains. Both human isolates L. rhamnosus VB1 and VB4 strains carried a single copy of the bsh gene, most likely underpinning their BSH potential. Among them, VB4 exhibited greater resistance to BAs condition and a higher deconjugation ability. Interestingly, VB1 displayed higher bsh expression than VB4 at stationary phase under BAs stress. L. brevis M3R3, isolated from sourdough, possessed two distinct bsh genes potentially contributing to BSH activity. This genetic feature supported a strong BAs deconjugation capacity and enhanced adaptability under bile salt conditions. Given its strong role in bile acid (BAs) deconjugation, strain VB4 was further investigated using the in vitro SHIME® model. Culture-dependent analyses confirmed its survival throughout the simulated digestive process. Moreover, gene expression and metabolomic profiling revealed an effective modulation of BA pools during intestinal transit, particularly in the colon phase, where interactions with the resident microbiota amplified the observed changes following VB4 administration. In parallel, functional assays were performed to evaluate the role of the three selected strains in cholesterol metabolism. Data demonstrated their capacity to assimilate cholesterol and to reduce micellar cholesterol uptake by Caco-2 cells, with VB1 showing the strongest adhesion and cholesterol-lowering efficiency, followed by VB4 and M3R3. Overall, these findings identify VB1 and VB4, together with M3R3, as promising BSH-positive strains with cholesterol-lowering potential. Their detailed characterization through probiogenomic analyses, dynamic gut models, and host-cell assays provides a solid framework for the development of next-generation probiotics aimed at regulating lipid homeostasis.

L’attività di idrolasi dei sali biliari (BSH) è riconosciuta come una caratteristica probiotica fondamentale, che collega la funzionalità del microbiota intestinale al metabolismo lipidico dell’ospite e alla salute cardiovascolare. La BSH è un enzima che catalizza la deconiugazione degli acidi biliari (BA), i quali svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento dell’omeostasi del colesterolo nell’ospite. I lattobacilli sono una specie batterica ampiamente riconosciuta tra i principali probiotici con attività BSH, capaci di migliorare la loro sopravvivenza nel tratto gastrointestinale, oltre che a contribuire alla riduzione del colesterolo. Questa tesi ha esaminato in dettaglio gli aspetti genomici, fenotipici e funzionali di tre ceppi BSH-positivi: Lacticaseibacillus rhamnosus VB1, Lacticaseibacillus rhamnosus VB4 e Levilactobacillus brevis M3R3, di origine umana e alimentare. Le analisi probiogenomiche e fenotipiche hanno rivelato caratteristiche genetiche ceppo specifiche, associate alla tolleranza ai BAs e alla capacità di deconiugazione in tutti e tre i ceppi studiati. Negli isolati umani L. rhamnosus VB1 e VB4 è stata riscontrata la presenza di una singola copia del gene bsh, riconducibile al loro potenziale BSH. Tra i due, VB4 ha mostrato una maggiore resistenza in presenza dei BAs e una più elevata capacità di deconiugazione. L. brevis M3R3, isolato da lievito madre, possiede due distinti geni bsh potenzialmente coinvolti nell’attività BSH, supportato da una robusta deconiugazione dei BAs e una crescita adattativa in presenza di sali biliari. Per via della sua spiccata deconiugazione dei BAs, VB4 è stato ulteriormente studiato utilizzando il modello in vitro SHIME®, dimostrando la persistenza del ceppo durante il processo digestivo simulato, a livello gastrico e intestinale, mediante metodi coltura-dipendenti. Inoltre, sono state condotte analisi di espressione genica e metabolomiche, che hanno indicato una modulazione efficace dei pool di BA durante il transito intestinale fino alla fase colica, dove l’interazione con il microbiota residente ha ulteriormente contribuito ai cambiamenti osservati in seguito alla somministrazione di VB4. In parallelo, sono stati condotti saggi funzionali per valutarne il coinvolgimento nel metabolismo del colesterolo. I risultati hanno confermato la capacità dei tre ceppi selezionati di assimilare colesterolo e ridurre l’assorbimento micellare di colesterolo da parte delle cellule Caco-2, con VB1 che ha mostrato la più elevata adesione ed efficienza ipocolesterolemizzante, seguito da VB4 e M3R3. Complessivamente, questi risultati identificano VB1 e VB4, insieme a M3R3, come potenziali ceppi BSH-positivi con attività di riduzione del colesterolo. Grazie a un approccio integrato che combina screening probiogenomico, modelli intestinali dinamici e saggi cellulari, è stato possibile delineare un quadro di riferimento utile allo sviluppo di probiotici avanzati destinati alla regolazione dell’omeostasi lipidica.