Crossing and NGTs for breeding in sicilian grapevine varieties [Incrocio e NGTs per il miglioramento genetico di varietà di vite siciliane]

Grapevine (Vitis vinifera L.) is a perennial fruit crop of high economic and cultural relevance, particularly in Sicily. A major challenge for viticulture is the diffusion of diseases such as powdery and downy mildew, whose management has traditionally relied on chemical control. Consequently, enhancing genetic resistance in grapevine varieties represents the most sustainable long-term strategy for disease management. This thesis focuses on six of the most important Sicilian grapevine varieties, three white-skinned (‘Carricante’, ‘Catarratto’, ‘Grillo’) and three red-skinned (‘Frappato’, ‘Nerello mascalese’, ‘Nero d’Avola’), as part of a project funded by the Istituto Regionale del Vino e dell’Olio (IRVO) of the Sicilian Region, in collaboration with the University of Catania and the ‘Consiglio per la Ricerca in Agricoltura e l’Analisi dell’Economia Agraria - Viticoltura ed Enologia’ (CREA-VE). Two complementary strategies were selected to pursue resistance improvement: crossing and genome editing through the CRISPR/Cas9 system. Crossing was performed over three years between the selected varieties and resistant hybrids previously developed by CREA-VE. The progeny was analysed through Marker Assisted Selection (MAS) to identify the presence of resistance loci, allowing early screening at the seedling stage. Powdery mildew tolerance was confirmed through in vitro bioassays. On the other hand, before applying a genome editing approach, it is crucial to establish a reliable in vitro protocol, particularly for obtaining embryogenic calluses and for the regeneration of whole plants. In this study, stamen and pistils were cultured in vitro, taking into account different variables such as the pollen developmental stage and two different induction media. Protocols for protoplast isolation and regeneration were also developed to enable CRISPR/Cas9 editing. Genome editing was performed to knock-out susceptibility genes of the Mildew Locus O (MLO) family, which are negative regulators of resistance to powdery mildew. We applied the CRISPR/Cas9 system using geminivirus-derived replicons to produce transgene-free edited plants. Editing experiments were performed targeting MLO3, MLO7 and MLO13/17 in both embryos and isolated protoplasts. Editing events were first evaluated by monitoring of Green Fluorescent Protein (GFP) expression, followed by molecular screening and sequencing. This thesis represents the first report of a research project aimed at developing Sicilian grapevine varieties with improved resistance traits. Both strategies were carefully evaluated, highlighting their successes as well as the potential challenges, and the results obtained are highly promising for enhancing the value of these genotypes as key germplasm resources for viticulture and oenology in Sicily.

La vite (Vitis vinifera L.) è una coltura arborea di notevole importanza economica e culturale, in particolare in Sicilia. Una delle principali sfide della viticoltura è la diffusione di malattie come l’oidio e la peronospora, la cui gestione si è tradizionalmente basata sul controllo con mezzi chimici. Di conseguenza, il miglioramento della resistenza delle varietà di vite rappresenta una strategia sostenibile a lungo termine per la gestione delle malattie. Questa tesi si concentra su sei delle varietà siciliane più importanti, tre a bacca bianca (‘Carricante’, ‘Catarratto’, ‘Grillo’) e tre a bacca rossa (‘Frappato’, ‘Nerello mascalese’, ‘Nero d’Avola’), nell’ambito di un progetto finanziato dall’Istituto Regionale del Vino e dell’Olio (IRVO) della Regione Siciliana in collaborazione con l’Università di Catania e il Consiglio per la Ricerca in Agricoltura e l’Analisi dell’Economia Agraria – Viticoltura ed Enologia (CREA-VE). Sono state selezionate due strategie complementari per perseguire il miglioramento delle caratteristiche di resistenza: l’ibridazione convenzionale ed il genome editing mediante il sistema CRISPR/Cas9. L’ibridazione convenzionale è stata effettuata nell’arco di tre anni tra le varietà selezionate e ibridi resistenti precedentemente sviluppati dal CREA-VE. La progenie è stata analizzata mediante Selezione Assistita da Marcatori (MAS) per identificare la presenza di loci di resistenza, consentendo una selezione precoce già allo stadio di plantula. La tolleranza all’oidio è stata confermata attraverso saggi in vitro. Per quanto riguarda l’approccio di genome editing, prima della sua applicazione è stato necessario stabilire un protocollo affidabile in vitro, in particolare per l’ottenimento di calli embriogenici e la rigenerazione di piante. In questo studio, stami e pistilli sono stati coltivati in vitro considerando diverse variabili, quali lo stadio di sviluppo del polline e due differenti terreni di induzione. Sono stati inoltre sviluppati protocolli per l’isolamento e la rigenerazione dei protoplasti, al fine di poter applicare il sistema CRISPR/Cas9. È stato usato il genome editing per inattivare geni di suscettibilità della famiglia genica MLO (Mildew Locus O), noti per essere regolatori negativi di resistenza. Il sistema CRISPR/Cas9 è stato utilizzato tramite repliconi derivati da geminivirus al fine di ottenere piante editate prive di transgeni. Sono stati condotti esperimenti di editing sui geni MLO3, MLO7 e MLO13/17 sia in embrioni, che in protoplasti. Gli eventi di editing sono stati inizialmente valutati monitorando l’espressione della Green Fluorescent Protein (GFP), seguita da screening molecolare e sequenziamento. Questa tesi rappresenta la prima testimonianza di un progetto di ricerca finalizzato allo sviluppo di varietà di vite siciliane con caratteri di resistenza migliorati. Entrambe le strategie sono state valutate con attenzione, evidenziandone sia i successi sia le potenziali sfide, e i risultati ottenuti risultano estremamente promettenti per valorizzare questi genotipi come risorse genetiche chiave per la viticoltura e l’enologia siciliana.