Intelligent bioprinting of cultured meat: coupling novel edible bioinks with in situ process monitoring

Livestock farming represents one of the leading contributors to greenhouse gas emissions, water depletion, and land use. Among emerging protein alternatives, Cultured Meat (CM) stands out as the only technology with the potential to replicate the sensory and nutritional properties of conventional meat while substantially reducing its environmental footprint. Bioprinting has emerged as one of the most promising fabrication strategies for producing structured CM constructs. How ever, two critical bottlenecks currently limit its translation to market scale: the lack of food-compatible biomaterials specifically designed for CM bioprinting, and the poor reproducibility and standardization of bioprinting processes. This thesis addresses both challenges through two parallel but interconnected research lines. On the biomaterial side, three systems are developed and characterized. A novel whey protein-based bioink is formulated for extrusion-based bioprinting, providing both structural scaffolding and myoblast adhesion sites. Hemp seed protein isolates are then investigated as a serum free alternative to FBS, integrated both within the bioink matrix and the culture medium and validated in a 3D extrusion model. A chitosan-based acid-free hydrogel is finally engineered into an inkjet-printable bioink, accompanied by detailed rheological charac terization. On the process side, a progressive framework of in situ monitoring strategies is developed across three bioprinting modalities. For inkjet bioprinting, a 23 Design of Experiments is implemented to model the printability of the chitosan-based bioink and identify optimal process parameters. This framework is extended to extrusion-based bioprinting through a full factorial DoE, introducing a probabilistic printability map that explicitly accounts for process uncertainty in the identification of optimal operating conditions. Finally, for embedded bioprinting, a modular in situ monitoring platform is developed, enabling high-fidelity reconstruction of printed structures during fabrica tion, and subsequently upgraded to fluorescence-based acquisition to allow direct in situ quantification of cell density along printed filaments. Taken together, the results of this thesis contribute to establishing a more rational and reproducible foundation for cul tured meat biofabrication, advancing the vision of an intelligent bioprinting platform in which novel edible bioinks are systematically coupled with in situ process monitoring to achieve controlled fabrication.

L'allevamento zootecnico rappresenta una delle principali fonti di emissioni di gas serra, consumo di risorse idriche e utilizzo del suolo. Tra le emergenti alternative proteiche, la Carne Coltivata (Cultured Meat, CM) si distingue come l'unica tecnologia in grado di replicare le proprietà sensoriali e nutrizionali della carne convenzionale, riducendone al contempo in modo sostanziale l'impatto ambientale. Il bioprinting è emerso come una delle strategie di fabbricazione più promettenti per la produzione di costrutti strutturati di carne coltivata. Tuttavia, due criticità fondamentali ne limitano attualmente la traslazione verso una produzione su scala industriale: la mancanza di biomateriali compatibili con l'ambito alimentare e specificamente progettati per il bioprinting della carne coltivata, e la scarsa riproducibilità e standardizzazione dei processi di bioprinting. Questa tesi affronta entrambe le sfide attraverso due linee di ricerca parallele ma strettamente interconnesse. Sul versante dei biomateriali, vengono sviluppati e caratterizzati tre differenti sistemi. Innanzitutto, viene formulato un nuovo bioink a base di proteine del siero del latte per il bioprinting per estrusione, in grado di fornire sia un'impalcatura strutturale sia siti di adesione per i mioblasti. Successivamente, gli isolati proteici di semi di canapa vengono investigati come alternativa priva di siero al siero fetale bovino (FBS), integrati sia all'interno della matrice del bioink sia nel mezzo di coltura, e validati in un modello tridimensionale ottenuto mediante bioprinting per estrusione. Infine, un idrogel a base di chitosano privo di acidi viene sviluppato come bioink stampabile mediante tecnologia inkjet, accompagnato da una dettagliata caratterizzazione reologica. Sul versante del processo, viene sviluppato un quadro progressivo di strategie di monitoraggio in situ applicato a tre diverse modalità di bioprinting. Per il bioprinting inkjet, viene implementato un piano sperimentale (Design of Experiments, DoE) 2^3 al fine di modellare la stampabilità del bioink a base di chitosano e identificare i parametri di processo ottimali. Tale approccio viene esteso al bioprinting per estrusione mediante un DoE fattoriale completo, introducendo una mappa probabilistica di stampabilità che considera esplicitamente l'incertezza di processo nell'identificazione delle condizioni operative ottimali. Infine, per il bioprinting embedded, viene sviluppata una piattaforma modulare di monitoraggio in situ, in grado di consentire la ricostruzione ad alta fedeltà delle strutture stampate durante la fabbricazione; tale piattaforma viene successivamente potenziata mediante acquisizione basata sulla fluorescenza, permettendo la quantificazione diretta in situ della densità cellulare lungo i filamenti stampati. Nel complesso, i risultati di questa tesi contribuiscono a porre basi più razionali e riproducibili per la biofabbricazione della carne coltivata, avanzando la visione di una piattaforma di bioprinting intelligente nella quale nuovi bioink edibili siano sistematicamente integrati con sistemi di monitoraggio in situ del processo, al fine di ottenere una fabbricazione controllata.