Hyperspectral imaging for biophysical applications in microscopy and remote sensing

This dissertation investigates the application of a commercial common-path interferometer for hyperspectral imaging in biophotonic applications, with particular focus on microscopy, remote sensing, and fluorescence imaging of biological tissues. The work first introduces the optical properties of biological tissues and reviews several studies related to tumor detection and surgical margin assessment, together with classical approaches for hyperspectral data analysis and classification. Particular attention is devoted to the SpectraBreast project, which provided the framework for a large part of the experimental activity. A theoretical and experimental investigation of the common-path interferometer is then presented. The relationship between interferograms and power spectra is described through the Wiener–Khinchin theorem and the calibration procedures are discussed in detail. A custom VIS-SWIR hyperspectral microscope for transmission imaging was developed and tested on unstained breast cancer histology slides. Although the measurements highlighted several technical limitations, the developed prototype demonstrated the feasibility of interferometric hyperspectral microscopy in the VIS-SWIR range. An extensive characterization of the HERA VIS-SWIR system was also carried out within the context of breast cancer tissue analysis. The performance of the device was evaluated under different illumination conditions by assessing parameters such as depth of field, imaging depth, signal intensity, and glare effects. Preliminary measurements on breast cancer specimens were performed in a clinical environment, demonstrating the potential of hyperspectral imaging for tissue discrimination, although the analysis was limited by the lack of pathological annotations and robust coregistration procedures. Finally, the dissertation explores the use of common-path interferometry for fluorescence hyperspectral imaging. Several spectral unmixing techniques were implemented and compared for the analysis of multi-stained biological samples acquired with a high-resolution hyperspectral microscope. In particular, non-negative least squares minimization proved effective for separating fluorophore contributions in multi-stained specimens. This work demonstrates the versatility of common-path interferometric hyperspectral imaging in biomedical applications. The presented results provide a foundation for future developments involving larger clinical datasets, advanced deep-learning approaches, multimodal comparison with Raman spectroscopy, and improved spectral unmixing strategies.

Questa tesi investiga l’applicazione di un interferometro commerciale a cammino comune per imaging iperspettrale in applicazioni di biofotonica, con particolare attenzione alla microscopia, al remote sensing e all’imaging in fluorescenza di tessuti biologici. Il lavoro introduce innanzitutto le proprietà ottiche dei tessuti biologici e passa in rassegna diversi studi relativi al rilevamento dei tumori e alla valutazione dei margini chirurgici, insieme ai metodi classici per l’analisi e la classificazione dei dati iperspettrali. Particolare attenzione è dedicata al progetto SpectraBreast, che ha costituito il contesto di gran parte dell’attività sperimentale. Viene successivamente presentata un’indagine teorica e sperimentale dell’interferometro a cammino comune. La relazione tra interferogrammi e spettri di potenza è descritta attraverso il teorema di Wiener–Khinchin e le procedure di calibrazione vengono discusse in dettaglio. È stato sviluppato un microscopio iperspettrale VIS-SWIR personalizzato per imaging in trasmissione e testato su sezioni istologiche non colorate di tumore al seno. Sebbene le misure abbiano evidenziato diverse limitazioni tecniche, il prototipo sviluppato ha dimostrato la fattibilità della microscopia iperspettrale interferometrica nell’intervallo VIS-SWIR. È stata inoltre effettuata un’estesa caratterizzazione del sistema HERA VIS-SWIR nel contesto dell’analisi di tessuti tumorali mammari. Le prestazioni del dispositivo sono state valutate in differenti condizioni di illuminazione analizzando parametri quali profondità di campo, profondità di imaging, intensità del segnale ed effetti di glare. Misure preliminari su campioni di tumore al seno sono state eseguite in ambiente clinico, dimostrando il potenziale dell’imaging iperspettrale per la discriminazione dei tessuti, sebbene l’analisi sia stata limitata dalla mancanza di annotazioni patologiche e di robuste procedure di coregistrazione. Infine, la tesi esplora l’utilizzo dell’interferometria a cammino comune per imaging iperspettrale in fluorescenza. Diverse tecniche di spectral unmixing sono state implementate e confrontate per l’analisi di campioni biologici multi-colorati acquisiti mediante un microscopio iperspettrale ad alta risoluzione. In particolare, la minimizzazione ai minimi quadrati non negativi (NNLS) si è dimostrata efficace nella separazione dei contributi dei diversi fluorofori nei campioni multi-colorati. Questo lavoro dimostra la versatilità dell’imaging iperspettrale interferometrico a cammino comune nelle applicazioni biomedicali. I risultati presentati costituiscono una base per sviluppi futuri che includono dataset clinici più ampi, approcci avanzati di deep learning, confronti multimodali con la spettroscopia Raman e strategie migliorate di spectral unmixing.