Analisi elettrofisiologica delle proteine VDAC umane incorporate nei nanodischi e indagine sui residui di cisteina dell'isoforma 3 VDAC nella funzionalità mitocondriale e nel tamponamento dei ROS

Mitochondria are crucial organelles for eukaryotic cells since they support the huge energy demand required to maintain cellular homeostasis. Communication between cytosol and mitochondria is allowed by mitochondrial porins, also known as Voltage-Dependent Anion selective Channels (VDACs), localized in the outer mitochondrial membrane of all eukaryotes. VDACs allow metabolite exchanges across the organelle and participate in numerous cellular pathways due to the interaction with cytosolic enzymes and apoptotic factors. There are three different isoforms in mammals: VDAC1, VDAC2, and VDAC3. Although sharing a high sequence homology, the three isoforms present different functions and characteristics. The first part of this Ph.D. thesis focuses on the electrophysiological analysis of VDAC proteins produced using a cell-free expression system associated with nanodiscs (NDs), which offer a native-like environment. This new expression method represents a powerful alternative to avoid protein refolding procedures. In this work, the in vitro protein synthesis system was used for the first time to express the three human VDAC isoforms. After their reconstruction into Planar Lipid Bilayer, the electrophysiological features were compared with those obtained by canonical expression protocol. Furthermore, we analyzed the impact of both reducing agents in the buffer and cysteine removal on the biophysical characteristics of human VDAC3. Our results showed that this new system did not change the electrophysiological features of VDACs, and additionally validated the extreme importance of cysteine residues in the channel functionality of VDAC3. The second part of the thesis concerns the investigation of human VDAC3 contribution in oxidative stress response. Among the three isoforms in mammals, VDAC3 has long been the research topic of De Pinto’s group as it represents the least abundant and the most enigmatic one. It features untypical biophysical properties that have been attributed to the specific oxidative status of its cysteine residues. Moreover, clues within the literature have suggested VDAC3 as a putative redox sensor, stressing its involvement in mitochondrial reactive oxygen species homeostasis. A direct proof, however, is missing. This work aimed to evaluate the role of VDAC3 on mitochondrial functionality using the near-haploid human HAP1 cell line devoid of VDAC3. This work revealed that VDAC isoform 3 prevents mitochondrial impairment induced by oxidative stress. For the first time, we have also proved that cysteine residues of VDAC3 are responsible for the ability of the protein to counteract mitochondrial ROS overload.

I mitocondri sono organelli essenziali per le cellule eucariotiche poiché sostengono l'enorme richiesta energetica, necessaria per mantenere l'omeostasi cellulare. La comunicazione tra il citosol e i mitocondri è consentita dalle porine mitocondriali, note anche come Voltage-Dependent Anion Selective Channels (VDACs), localizzate nella membrana mitocondriale esterna di tutti gli eucarioti. Le proteine VDAC permettono gli scambi di metaboliti e partecipano a numerose vie cellulari grazie all'interazione con specifici enzimi citosolici e fattori apoptotici. Nei mammiferi esistono tre diverse isoforme, conosciute come VDAC1, VDAC2 e VDAC3. Pur condividendo un'alta omologia di sequenza, le tre isoforme presentano funzioni e caratteristiche diverse. La prima parte di questa tesi di dottorato si focalizza sull'analisi elettrofisiologica delle proteine VDAC prodotte utilizzando un sistema di espressione cell-free associato a nanodisc. Questo nuovo metodo di espressione rappresenta una potente alternativa per evitare le procedure di ripiegamento in vitro delle proteine. In questo lavoro, il sistema di sintesi proteica in vitro è stato usato per la prima volta per esprimere le tre isoforme VDAC. In particolare, è stato investigato se il sistema cell-free associato ai nanodisc, mantenesse inalterate le caratteristiche elettrofisiologiche dei canali VDAC. Inoltre, è stato valutato l'impatto sulle caratteristiche biofisiche di VDAC3 in seguito a pre-trattamento della proteina con agente riducente (DTT) e dopo la rimozione dei residui di cisteina nella sequenza amminoacidica mediante mutagenesi sito-diretta. I nostri risultati hanno dimostrato che questo nuovo sistema mantiene immutate le caratteristiche elettrofisiologiche delle proteine VDAC e inoltre ha convalidato l'estrema importanza dei residui di cisteina sull’attività canale di VDAC3. La seconda parte della tesi riguarda l'indagine del contributo di VDAC3 nella risposta allo stress ossidativo. VDAC3 rappresenta la meno abbondante e la più enigmatica isoforma ed è stata a lungo l'argomento di ricerca del gruppo di De Pinto. L’isoforma 3 presenta proprietà biofisiche atipiche che sono state attribuite allo stato ossidativo dei suoi residui di cisteina. Inoltre, alcune evidenze in letteratura hanno suggerito che VDAC3 potrebbe essere un sensore redox, sottolineando il suo coinvolgimento nell'omeostasi mitocondriale delle specie reattive dell'ossigeno. Una prova diretta, tuttavia, manca. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di valutare il ruolo di VDAC3 sulla funzionalità mitocondriale utilizzando la linea cellulare umana HAP1 knock-out di VDAC3. Questo lavoro ha rivelato che VDAC3 previene il deterioramento mitocondriale indotto dallo stress ossidativo. Inoltre, è stato dimostrato, per la prima volta, che i residui di cisteina di VDAC3 sono responsabili della capacità della proteina di contrastare l’eccesso dei ROS mitocondriali.