Isolation and characterization of urine-derived stem cells as a novel modeling tool to study hereditary neuromuscular diseases

Basi scientifiche: Le cellule staminali dervanti dalle urine (Urine derived stem cells o USCs) sono state recentemente identificate come fonte di cellule staminali pluripotenti o iPSC. Queste cellule sono estremamente interessanti poichè rappresentano un modello cellulare utilizzabile per studiare e meglio comprendere le patologie umane, in un ampio spettro di funzioni, dalla patogenesi, ai meccanismi eziologici, a nuove terapie. Le loro caratteristiche di staminalità le rendono inoltre adatte per valutare nuovi farmaci sperimentali. Le urine si possono ottenere in modo completamente non invasivo e di conseguenza i pazienti e in generale gli individui sono molto complianti per tale esame, che puo essere ripetuto nel tempo. Le cellule del sedimento urinario, incluse le cellule staminali, sono quindi facilmente ottenibili e rapidamente isolabili. Esse possono anche essere utilizzate come strumento per la diagnosi genetica e proteica, e la loro natura non invasiva le rende una ottima sorgente cellulare per monitorare i trattamenti sperimentali presumibilmente di un numero svariato di malattie genetiche con diversa origine. Scopo: Questo studio ha avuto l’obiettivo di mettere a punto un protocollo e una strategia per isolare cellule staminali da urine di pazienti e controlli, e in seguito utilizzare le cellule per valutare in esse l’assetto genetico, trascrittomico, proteomico del gene distrofina, sia in pazienti Duchenne che in controlli. La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una patologia ereditaria recessiva legata al cromosoma X e causata da una ampia varietà di mutazioni nel gene distrofina. Metodi: In questo lavoro le cellule urinarie staminali sono state isolate da urine di controlli e di un paziente DMD. Il paziente DMD aveva una mutazione per delezione che coinvolgeva l’esone 45. Le USCs isolate sono state caratterizzate per i marcatori di superficie. Per studiare il trascritto ditrofina sia nelle USCs native che in quelle rese miogeniche tramite trasfromazione con fattore MyoD sono state utilizzate delle fluidic cards, una metodica che si basa su un saggio quantitativo TaqMan. Le fluidcards per il gene DMD (FluiDMD) nel profilano l’intero trascritto, comprese le giunzioni esone-esone e le diverse isoforme. Le USCs trasformate con MyoD sono state differenziate in miotubi e trattate con molecole 2’OMePS antisenso (esone 44) per indurre un exon skipping terapeutico. Lo skipping dell’ esone 44 determina infatti nei pazienti DMD con delezione dell’esone 45 un recupero della trascrizione e della conseguente espressione della distrofina nel sarcolemma, che è stata visualizzata tramite immunoistochimica e western blotting. Risultati: il nostro studio ha dimostrato che le USCs native esprimono fisiologicamente la distrofina a livello trascrizionale ma non la protein e che nel paziente DMD il profilo genotipico è riprodotto nelle cellule sia a livello del DNA che dell’ RNA. Al contrario, la proteina distrofina è presente solo nelle USCs trasformate con MyoD e quindi rese miogeniche del controllo. Il trattamento con antisenso ripristina la sintesi della proteina nel paziente DMD tramite lo skipping favorevole dell’esone 44. L’ effetto dell’antisenso è visibile sia nelle USCs native (trascritto) che in quelle rese miogeniche (trascritto e proteina). Conclusioni: In conclusione, noi abbiamo dimostrato che le USCs rappresentano un ottimo modello cellulare sia per la diagnosi che per approcci terapeutici in vitro per la Distrofia muscolare di Duchenne. La loro natura completamente non invasiva ne facilita l’utilizzo e le condizioni standardizzate di isolamento e crescita supportano la loro applicazione anche per screening di nuove molecole terapeutiche. Non ultimo, la loro origine mesenchimale e la loro pluripotenzialita' le candidano anche come sorgente per terapie cellulari.

Background: Urine derived stem cells (USCs) have become a novel source for generating human induced pluripotent stem cells (iPSCs) that can be used as a disease model for understanding the pathogenesis, disease mechanism and exploring drug-screening platforms for rare human diseases. The isolation of stem cells from urine is considered to be noninvasive, simple, affordable, ubiquitous, and readily accepted by patients. Therefore, it could be used as a diagnostic tool for many human genetic disorders. Aims: This study aimed to set up a protocol for the isolation of stem cells from urine specimens and to use these cells for functional genetic studies in Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), a rare X-linked recessive inherited disease caused by a variety of dystrophin gene mutations. Methods: In the present study USCs were isolated from urine samples collected from two healthy donors and one DMD patient with a deletion of exon 45. The isolated USCs were characterized by surface markers.To profile the dystrophin transcript in both native and myogenic transformed USCs we used DMD gene micro-fluidic card (FluiDMD), a TaqMan gene expression assay that profiling the entire dystrophin transcript including all exon-exon junctions. Furthermore, myotubes obtained from MyoD-transformed DMD USCs were treated with antisense oligoribonucleotide (AON) for dystrophin exon 44 skipping and the exon skipping percentage was quantified. The AON 44 is a known experimental drug used for the exon skipping therapy approach to reframe dystrophin transcript in DMD boys. Finally, the dystrophin protein expression was analyzed using immunostaining analysis and Western blotting. Results: This study demonstrated that native urine-derived stem cells expressed the full-length dystrophin transcript, and the dystrophin mutation was retained in the cells of the patient with DMD, both at DNA and RNA level, while the dystrophin protein was detected solely in control cells after myogenic transformation according to the phenotype. The treatment with antisense oligoribonucleotide against dystrophin exon 44 induced skipping in both DMD native and DMD MyoD-transformed urine-derived stem cells, with a successful therapeutic transcript-reframing effect, as well as visible protein restoration in the latter. Conclusion: This study suggested that native urine stem cells could represent a non invasive and cost effective human cell model to study the dystrophin transcript and can be used as a source to explore DNA and RNA profiles and to test new drugs for therapeutical approaches in DMD and other neuromuscular diseases.