Terapia epigenetica nel glioblastoma multiforme: valutazione degli effetti antineoplastici di acido valproico e resveratrolo su linee di cellule staminali tumorali

Il glioblastoma multiforme (GBM) è la neoplasia maligna più frequente fra i tumori cerebrali primari. La prognosi è, generalmente, infausta, in quanto le terapie attuali consentono una sopravvivenza media di soli 12-15 mesi dopo l’asportazione chirurgica, con una percentuale di recidiva pari all’80%. La principale causa del fallimento delle attuali strategie terapeutiche è la presenza, all’interno della massa tumorale, di una sottopopolazione di cellule con caratteristiche staminali, denominate Brain Tumor Stem Cells (BTSCs), in grado di sostenere la cancerogenesi, instaurare meccanismi di resistenza e determinare la recidiva. Di conseguenza, le BTSCs devono rappresentare il target principale dello sviluppo di nuove terapie, in quanto la loro eliminazione risulta essenziale per una definitiva eradicazione della neoplasia. Negli ultimi anni, la comprensione del ruolo delle alterazioni epigenetiche nella cancerogenesi e nella progressione tumorale ha suggerito la possibilità di agire terapeuticamente su questo versante, al fine di ripristinare il fisiologico status epigenetico delle cellule, sfruttando la reversibilità delle aberrazioni epigenetiche. Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare gli effetti antineoplastici di due farmaci ad azione epigenetica quali l’acido valproico (VPA), un inibitore delle istone deacetilasi di classe I e IIA, e il resveratrolo (RSV), un attivatore della sirtuina I, una istone deacetilasi di classe III, su sette linee di cellule staminali tumorali da GBM. In primis, è stata eseguita un’analisi dell’attività metabolica sulle linee in studio, tramite MTT assay, per valutare se i due farmaci, somministrati per 24-48-72 ore a diverse concentrazioni, avessero un effetto inibitorio su questo parametro. Successivamente, è stata effettuata l’analisi dell’indice mitotico su cellule trattate con VPA 2 mM e RSV 100 μM per 48 ore al fine di verificare la presenza di un effetto antiproliferativo esercitato dai farmaci in studio. L’indice mitotico è risultato fortemente diminuito da entrambi i farmaci rispetto ai controlli. Inoltre, è stato eseguito uno studio della morfologia cellulare dopo trattamento con concentrazioni crescenti di VPA e RSV: questo esperimento ha evidenziato l’insorgenza di drastiche variazioni della morfologia cellulare determinate dal VPA. In seguito, l’ effetto prodifferenziativo del VPA, osservato dopo 14 e 30 giorni di esposizione alla concentrazione di 2 mM, è stato caratterizzato a livello molecolare tramite saggi di immunofluorescenza, che hanno permesso di identificare le variazioni dell’espressione di marcatori di staminalità (CD133 e Nestina) e differenziamento (GFAP, β III tubulina, MBP), in percentuali diverse a seconda della linea. Per verificare se VPA e RSV fossero in grado di influenzare la motilità di queste cellule, le colture sono state incubate per 48-72-96 ore a differenti concentrazioni dei due farmaci ed è stato, successivamente, eseguito il saggio di migrazione Wound Healing Assay. Il trattamento con RSV ha mostrato un evidente effetto inibitorio sulla motilità cellulare, mentre il trattamento con VPA ha fatto registrare risposte più eterogenee tra le linee testate. Infine, è stato verificato, tramite Real Time PCR array, se la somministrazione di VPA 2 mM e RSV 100 μM per 96 ore fosse in grado di modificare l’espressione di geni coinvolti nel pathway molecolare di Wnt, un’importante via di segnalazione cellulare implicata nella regolazione della proliferazione, nell’induzione del differenziamento e nella migrazione cellulare. I risultati ottenuti hanno evidenziato un probabile effetto inibitorio del VPA sul pathway di Wnt canonico, suggerito anche dalla riduzione dei livelli di β catenina nucleare saggiati tramite immunoblot, mentre il RSV è sembrato, invece, promuovere tale via di trasduzione del segnale. I risultati ottenuti incoraggiano l’utilizzo di farmaci epigenetici nel contesto di una futura terapia per la cura del glioblastoma multiforme, anche in combinazione con altri composti. Sono necessari ulteriori studi, sia in vitro che in vivo, al fine di confermare e di caratterizzare in maniera più approfondita gli effetti antineoplastici di tali farmaci.