Modulation of circadian rhythms by glucocorticoids

Behavior is conceived as a stimulus-response dependent relationship between a sensory input and a motor output. While moving from an input to an output, internal homeostasis is continuously shaped to maintain an optimal energies expenditure balance. The ultimate purpose of enabling animals to adjust their homeostasis with the surrounding world is by producing adaptive behaviors in order to increase their fitness in light of natural selection. The environment can be either predictable or unpredictable. The former condition led to the evolution of the circadian rhythm to promote an active behavior at the time you mostly benefit from, while the latter take advantage of glucocorticoids axis to face sudden challenges. Thus, a crosstalk between the circadian and the glucocorticoid systems allows a fine tuning of animal’s activity. My goal is to understand the circadian-glucocorticoids dialogue by monitoring the locomotor daily/circadian behavior and its molecular oscillation counterpart under differentially phased light and feeding cycle. My model species is the zebrafish, particularly, I utilized a CRISPR/Cas9 mutant lacking the capability to coordinate glucocorticoids transcription because it lacks functional receptors which permit a correct ligand-receptor interaction. As a result, level of circulating glucocorticoids stays raised conferring an anxiety-related phenotype to the mutant. Zebrafish gr-/- has been built and kindly provided by Dr. Luisa Dalla Valle, University of Padua. Systematic behavioral analysis in gr-/- larvae and adults showed that the light entrainable locomotor activity is synchronized to the zeitgeber and maintain its oscillatory properties in absence of any cue. The onset of daily locomotor activity occurred one day later in mutants with respects to the wild type. This delay is linked to the slower striated muscle development in the gr-/- which recover regular fiber density at 6 days post fertilization. Furthermore, gr-/- larvae showed differences in the expression levels or in the peak phase of positive (arntl1a and clock1a) and negative (per1, per2a and cry1a) elements of the molecular clock. Outside the core clock network, an analysis on gr-/- adult livers reported an abolished daily expression of pck2, a gene involved in gluconeogenesis. In addition, srebp1 expression level has an anticipated acrophase in gr-/-. Feeding entrainment fails to occur in the mutants. Larvae and adults produced abnormal profiles of circadian locomotor activity. Further molecular investigation revealed this behavioral disruption wasn’t associated with a breakdown of molecular rhythms in the core clock genes. Nevertheless, the molecular phenotypes observed during feeding entrainment underlined a cry1a lack of rhythmicity. These data suggest the existence of a blurred boundary between the circadian-glucocorticoids crosstalk. A complex organization of the two produces an altered behavioral output in a food entrained schedule in gr-/- zebrafish. The proximate cause of input and output misalignment underlying food entrained locomotion has not been provided, but a step towards a more exhaustive comprehension about the circadian-glucocorticoids interaction paves the way for an in-depth investigation.

Il comportamento è concepito come una relazione dipendente stimolo-risposta tra un input sensoriale e una risposta motoria. Nel passaggio da input a output, l’omeostasi interna è continuamente modellata per mantenere un equilibrio ottimale della spesa energetica. Lo scopo ultimo di mantenere l’omeostasi in relazione al mondo circostante viene raggiunto attraverso la produzione di comportamenti adattativi che permettono di incrementare la fitness alla luce della selezione naturale. L’ambiente circostante può essere sia prevedibile sia imprevedibile. La prima condizione ha portato all’evoluzione del ritmo circadiano che promuove la fase di attività durante il momento più favorevole della giornata, mentre la seconda si serve dell’asse dei glucocorticoidi per affrontare le sfide imprevedibili. Quindi, un dialogo tra il sistema circadiano e il sistema dei glucocorticoidi è mantenuto allo scopo di ottenere una regolazione ottimale dell’attività animale. Il mio obiettivo è quello di capire il dialogo tra i due sistemi monitorando il comportamento giornaliero e circadiano, e la sua controparte molecolare, in fase a differenti cicli di luce e cibo. La mia specie modello è lo zebrafish (Danio rerio), in particolare, ho utilizzato un mutante costruito con la tecnica CRISPR/Cas9 che manca della capacità di coordinare la via di trascrizione dei glucocorticoidi a causa della mancata funzionalità del loro recettore cognato tale che l’interazione ligando recettore non è mantenuta. Di conseguenza, i livelli circolanti di glucocorticoidi restano elevati, conferendo al mutante un fenotipo ansioso. Zebrafish gr-/- è stato costruito e gentilmente fornito dal laboratorio della Prof.ssa Luisa Dalla Valle, Università degli studi di Padova. L’analisi sistematica del comportamento in larve e adulti di gr-/- ha mostrato che l’attività locomotoria sincronizzata alla luce mantiene le sue proprietà oscillatorie endogene. Tuttavia, l’attività locomotoria giornaliera insorge con un ritardo di un giorno nei mutanti rispetto ai wild type. Questa insorgenza ritardata è associata a un rallentamento nello sviluppo del tessuto muscolare striato, la normale densità delle fibre muscolari viene ripristinata nei gr-/- al sesto giorno dopo la fertilizzazione. Inoltre, le larve gr-/- hanno mostrato differenze nei livelli di espressione e nelle relative acrofasi di elementi positivi (arntl1a and clock1a) e negativi (per1, per2a and cry1a) dell’orologio molecolare. Al di là degli elementi del cuore dell’orologio circadiano, un’analisi nel fegato di adullti gr-/- rivela un’abolizione dell’espressione di pck2, un gene implicato nella gluconeogenesi. In aggiunta, srebp1 ha un’acrofase anticipata nei mutanti. La sincronizzazione circadiana al cibo fallisce nei gr-/-, sia larve sia adulti producono profili anomali dell’attività locomotoria. L’analisi molecolare non associa la disfunzionalità comportamentale a quella genetica, infatti i geni orologio non mostrano alterate oscillazioni a eccezione di cry1a. Questi dati suggeriscono l’esistenza di un confine sfuocato tra il sistema circadiano e quello dei glucocorticoidi e una complessa organizzazione dei due ha prodotto un alterato output comportamentale negli zebrafish gr-/-. La causa prossima del disallineamento tra lo stimolo alimentare e la locomozione non è stata chiarita sebbene un passo avanti verso una maggiore comprensione del dialogo tra glucocorticoidi e orologio circadiano getta le basi per un’indagine più profonda.