Molecular Mechanisms Involved In Krabbe's Disease

Krabbe disease is an autosomal recessive disorder resulting in the deficiency of galactosilcerebrosidase (GALC), a lysosomal enzyme involved in the catabolism of two lipids extremely represented during formation of myelin sheet: galactosylceramide and psychosine. Despite the GALC activity deficiency, galactosylceramide does not increase in the brain of patients, while psychosine accumulation is reported as cause of myelin-generating cells death and of severe neurodegeneration. The present work outlined a molecular explanation for how psychosine mediates a dose-dependent cell death in oligodendrocytes precursor and fibroblast cells with and without GALC mutation. In addition, it was analyzed how this mechanism may interfere in oligodendrocytes maturation. The connexins play essential roles in cell homeostasis, growth, differentiation and death. Among connexin family members, Connexin43 is recently reported as an active element in apoptosis by gap junction-dependent or -independent mechanisms. Still today, there are no scientific researches evaluating Connexin43 expression and localization in normal and in GALC mutated oligodendrocytes precursor cells. The results of this study established that the different effects of exogenous psychosine addition could be linked to different sensitivity of cell membrane. Furthermore, it was determined a primary involvement of cell proliferation and a relationship between caspase-3 activation and disturbance of membrane-activated protein involved in cellular growth and survival. Psychosine treatments resulted in proteolysis of procaspase-3 proportioned to PTEN up-expression and PI3K activity down-regulation, confirmed by Bad release, p53 enhanced levels and decrease of NF-kB. The intrinsic apoptosis activation was established. Moreover, psychosine treated oligodendrocyte precursors increased Connexin43, demonstrating preferential intracytoplasmatic localization and indicating that no gap- junction was involved. These in vitro findings were supported by examination of Connexin 43 levels in mouse brains: wild-type mouse brain proteins were compared to those ones of twitcher mouse, a natural occurring model of Krabbe disease. Reminding that Connexin43 never was found in mature oligodendrocytes, the second part of this work was pioneer in evaluating Connexin43 expression during wild-type- and GALC-mutated oligodendrocytes maturation steps without psychosine treatment. In experimental condition applied, it was verified that wild-type oligodendrocyte progenitors differentiate into a mature phenotype with loss of Connexin43. Under the same condition, GALC-mutated oligodendrocyte precursor did not express marker of maturity, they became multinuclear and Connexin43 levels remained higher than control, suggesting that psychosine is accumulating in early steps of oligodendrocyte precursor cell maturation. Taken together, these findings led to the general idea that psychosine may functionally impact cells through interference on the growth system and alteration in maturation programme, strongly related to Connexin 43 expression. Thus, the third part of this work probed the likelihood of using adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (AT-MSCs) as source of oligodendrocytes. Two different conditioned media were used and the results demonstrated that AT-MSCs can be influenced by the environment versus a neural phenotype. For this reason, stem cells can furnish potential material for cell replacement therapy. In summary, this thesis provides a new and unexplored molecular-mechanism for understanding the appearance and maintaining Krabbe disease hallmark. This work is the first description of a potential Connexin43 involvement in oligodendrocytes maturation and psychosine-inducted toxicity.

La leucodistrofia di Krabbe o a cellule globoidi è un disturbo autosomico recessivo a carico del gene codificante per galactosilcerebrosidase (GALC). GALC è coinvolto nel catabolismo di due lipidi molto prodotti nel processo di formazione della guaina mielinica: galactosilceramide e psicosina. A differenza delle classiche lipidosi, galactosilceramide non si accumula nel cervello di pazienti, mentre ciò non accade per la psicosina, che determina la scomparsa degli oligodendrociti cui fa seguito una severa demielinizzazione e neurodegenerazione invalidante. Questo studio è stato rivolto all approfondimento di alcuni meccanismi molecolari tramite i quali la psicosina determina l induzione dell apoptosi in precursori di oligodendrociti e in fibroblasti con e senza mutazione a carico del gene GALC. Poiché, fino ad oggi, non sono mai state condotte ricerche mirate a valutare l espressione e la localizzazione di proteine che svolgono ruoli essenziali nell omeostasi e nella comunicazione cellulare mediata dalle gap-junctions di membrana in precursori di oligodendrociti privi o dotati della deficienza di GALC, l eventuale coinvolgimento della Connessina43 è stato considerato. I meccanismi che interferiscono nel processo di maturazione degli oligodendrociti e la possibilità di impiegare cellule mesenchimali staminali ottenute da tessuto adiposo in malattie neurodegenerative sono state, inoltre, esaminati. I risultati hanno dimostrato che la psicosina esogena determina effetti differenti sui modelli utilizzati che dipendono dalla diversa sensibilità delle singole tipologie di cellule alle varie concentrazioni di lipide usato. La psicosina ha influenzato primariamente la proliferazione e la crescita cellulare, determinando l attivazione di un programma apoptotico mediando l'attivazione della caspase-3 e alterando i livelli di PTEN e PI3K, coinvolti nella crescita e sopravvivenza cellulare. In parallelo, la presenza della psicosina ha determinato nei modelli cellulari impiegati la proteolisi della procaspase-3, l aumento di espressione di Bad e di p53 e l attenuazione dell attivazione di NF-kB. Gli effetti più severi sono stati registrati nei precursori degli oligodendrociti piuttosto che nei fibroblasti. La presente ricerca ha dimostrato, per la prima volta, che i precursori di oligodendrociti esprimono Connessina43, normalmente espressa negli astrociti, ma non negli oligodendrociti maturi. Inoltre, gli alti livelli intracitoplasmatici di Connessina43 giustificano le differenze dose-dipendenti del danno indotto dalla psicosina e il mancato sviluppo del fenotipo maturo dei precursori di oligodendrociti. Da quest ultima considerazione è nata la curiosità di indagare sulla probabilità di rimpiazzare gli oligodendrociti non maturati con cellule mesenchimali staminali ottenute da tessuto adiposo (AT-MSCs). Gli studi in vitro, descritti in questo lavoro, hanno dimostrano che le AT-MSCs possono essere indirizzate dal milieu extracellulare verso un fenotipo neurale e, nello specifico, oligodendrocitario. Benché i risultati evidenzino che le AT-MSCs possano fornire un potenziale materiale per la cell replacement therapy , nuovi esperimenti sono necessari per confermare questa ipotesi. In conclusione, i risultati presentati in questa tesi offrono un meccanismo molecolare nuovo e inesplorato per comprendere gli aspetti patognomonici della leucodistrofia di Krabbe. Inoltre, suggeriscono per la prima volta un potenziale coinvolgimento della Connessina43 nella mancata maturazione degli oligodendrociti e nella tossicità indotta dalla psicosina e forniscono i preliminari per una cell replacement theraphy applicata a patologie neurodegenerative.