MULTIDISCIPLINARY APPROACHES AND INTERACTION NETWORK IN THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF RHEUMATOID ARTHRITIS

I differenti approcci multidisciplinari affrontati e descritti nella presente tesi sono stati effettuati con l'intento di arricchire le conoscenze in ambito di Artrite Reumatoide (AR), patologia a eziologia multifattoriale, progressiva ed autoimmune. Lo studio caso-controllo, focalizzato sull'individuazione di un profilo genetico di rischio in pazienti italiani con diagnosi di AR, ha riportato la variante HLA-DQA2 rs9275595 T>C significativamente associata ad insorgenza. L'analisi delle interazioni SNP × SNP ha rivelato un significativo effetto sinergico della combinazione fra le varianti HLA-DQA2 rs9275595 e HLA-DRB1 rs660895 A>G, suggerendo che, oltre al singolo effetto, il risultato maggiore si ha dall'interazione fra varianti appartenenti al complesso HLA. L'identificazione di biomarkers predittivi di suscettibilità, di progressione e di efficacia del trattamento impiegato è stata condotta in pazienti con Artrite Indifferenziata/Artrite Reumatoide Precoce (UA/ERA). Il follow-up a 6 mesi ha consentito la stratificazione dei soggetti UA in base all'insorgenza o meno della patologia, mentre per i pazienti ERA in base alla variazione del DAS28 (Disease Activity Score). I risultati delle interazioni genetiche e sierologiche relativamente alla progressione di AR, hanno individuato un algoritmo predittivo di efficacia terapeutica, evidenziando una relazione sinergica fra il Fattore Reumatoide (RF), la Resistina e la variante HLA-DRB1 rs6910071 A>G. Focalizzandosi sullo studio del dimorfismo sessuale, è stato riportato un significativo effetto genere-dipendente nel contesto della farmacogenetica del Methotrexate (MTX): infatti la variante HLA-G 14bp D>I costituisce un fattore predittivo dell'inefficacia del MTX solo nelle pazienti femmine. Approfondendo l'indagine su peculiari caratteristiche del genere femminile che possano interagire con il genotipo HLA-G, è risultata una forte associazione fra la presenza di precedenti gravidanze accertate, il genotipo HLA-G 14bp D/I e l'inefficacia al MTX. Considerando l'elevata espressione di HLA-G a livello del trofoblasto e il suo coinvolgimento nelle poliabortività, è stato indagato il microchimerismo fetale (fMC), già noto per essere presente nel sangue di donne affette da patologie autoimmuni, come AR e Lupus Eritematoso Sistemico (LES), anche dopo molti anni dalla gravidanza o dall'evento abortivo. Lo studio caso-controllo ha rilevato significativa presenza di fMC maschile nel campione ematico periferico di pazienti lupiche. La sintomatologia sistemica di LES potrebbe giustificare l'elevata presenza di fMC maschile nelle pazienti lupiche rispetto alle pazienti AR. Indagando le biopsie sinoviali di donne affette da AR, non è stata rivelata presenza di fMC maschile, suggerendo il possibile ruolo delle cellule microchimeriche come elementi di supporto e di rescue nel miglioramento della patologia. Sarebbe, dunque, possibile individuare cellule fMC solo nei casi di pazienti con AR stabile o in fase di remissione. Infine, è stata esplorato il profilo epigenetico attraverso analisi di metilazione di LINE-1 e dei geni HLA-G e MTHFR, su soggetti sani di controllo, su pazienti con artrite agli esordi e su pazienti con diagnosi accertata di AR. HLA-G ha evidenziato una significativa ipermetilazione nelle pazienti donne con AR rispetto agli uomini; mentre MTHFR ha rivelato una significativa ipometilazione, gradualmente maggiore a seconda della progressione di AR. In conclusione, i risultati esposti nella presente tesi hanno evidenziato il network di interazioni come importante elemento causativo di insorgenza e risposta terapeutica di AR. Inoltre, il focus sulle pazienti donne affette da AR ha enfatizzato l'applicazione della medicina di genere; infine, lo studio di epigenetica è il primo ad indagare lo stato di metilazione e la progressione di AR, sottolineando l'importanza del contributo ambientale e consentendo una nuova direzione esplorativa.

The multidisciplinary approaches described and reported in the present thesis were performed with the aim to gain new insight into Rheumatoid Arthritis (RA), multifactorial, progressive and autoimmune disease. The case-control study, focused on the genetic occurrence risk of RA in a complete Italian casuistry, reported the HLA-DQA2 rs9275595 T>C variant strongest associated to RA susceptibility. SNP × SNP investigation revealed significant synergic combined effect between HLA-DQA2 rs9275595 and HLA-DRB1 rs660895 A>G variants, suggesting that, beyond single variant association, the powerful gain arises from interaction between variants belonging to HLA complex. The predictive biomarkers identification of occurrence, progression and therapy efficacy has been carried out in Undifferentiated Arthritis/ Early Rheumatoid Arthritis patients (UA/ERA). Follow-up after 6 months from the first visit has allowed to stratify subjects accordingly to disease evolution (from UA to RA) and to disease progression (from ERA to RA) using DAS28 variation (Disease Activity Score). Interaction study between genetics and serological parameters reported a significant combined effect of Rheumatoid Factor (RF), resistin and HLA-DRB1 rs6910071 A>G, playing a role together to predict "best responders", the group of patients with higher DAS28 improvement. Focusing on the influence of sexual dimorphism, a statistical significant gender-dependent effect has been shown in the context of Methtotrexate (MTX) pharmacogenetics: RA women D/I for HLA-G 14bp D>I variant reported significant higher MTX inefficacy, whereas male trend of association was completely opposite. Investigating on women previous obstetric history, it came out the association between the ascertained pregnancies, HLA-G 14bp D/I genotype and MTX inefficacy. Thus, we focused the approach on the particular women-view, underlying how pregnancy and miscarriage could exert an important and discriminant role in the disease pathogenesis. Pregnancy represents a physiological context requiring immune tolerance toward the fetus and, especially during the first trimester, exists a bidirectional trafficking of cells and DNA in the fetus-maternal interface that can results in naturally acquired microchimerism in both mother (fMC) and fetus. Male fMC could be detected in women bloodstream even after many years from the childbirth and in fact, our findings revealed the presence of male fMC in SLE patients' bloodstream. The widespread symptoms of SLE could justify the higher presence of fMC than which has detected in RA patients' bloodstream and the investigation on localized RA affected synovium might be crucial to understating fMC role. Exploring women synovial biopsies, it failed to reveal positive detection of fMC, empathizing that microchimeric cells can exert a rescue role, acting as stem cells repairing tissues injuries; thus, it has possible to detect fMC cells only in slight or mild RA cases. Finally, we explored the epigenetic profile, through the methylation analysis of LINE-1 and of specific genes HLA-G and MTHFR. Study has been carried out on healthy subjects, passing through early symptoms, to established RA diseased patients. HLA-G gene was significant hypermethylated in female RA patients, respect to RA males. Significant hypomethylation was identified in MTHFR gene, with a progressive rising to the increase of disease establishment, suggesting that epigenetic state persists beyond RA stages. In conclusion, the evidences presented in this thesis underlined the interaction network as the important causative factor of RA susceptibility and therapy efficacy. In addition, results on RA affected women emphasized the gender medicine application. Lastly, the epigenetic study is the first to explore methylation status over the time and progression of RA disease, highlighting the environmental contribution and opening new directional window in the RA knowledge.