LA GENETICA DEL VOMITO CICLICO (CVS): ARRAY CGH, NGS E ANALISI DEL DNA MITOCONDRIALE IN MULTIPLE FAMIGLIE E REVISIONE DELLA LETTERATURA

Cyclic vomiting syndrome has an entry [MIM # 500007] in the online catalogue of Mendelian Inheritance in Man [OMIM 2020] in which it is currently attributed to mutations in the mitochondrial transfer RNA-leucine [MTTL1; MIM # 590050] gene. Phenotipically, a subset of patients, with cyclic vomiting syndrome, is also recognised [Cyclic vomiting syndrome plus], as having coexisting neuromuscular disorders, with cognitive delay, myopathy, or seizure disorders. Additional differences within the cyclic vomiting syndrome have been recorded by Li and colleagues [1999] in the majority (82%) of their 214 children with CVS who had associated migraines, less severe vomiting and higher response rates to anti-migraine therapy. Families with CVS running through multiple generations have been anectodically reported. Nowadays, we know that cyclic vomiting (syndrome), migraines, epilepsy and other gastrointestinal motility functional disorders all apparently underlie some forms of mitochondrial dysfunction. This dysfunction, in mitochondrial unbalance, could be subclinical at baseline, but exacerbated by physiological stressors such as an acute systemic illness. Inherited disorders of metabolism [e.g., fatty acid oxidation disorders, mitochondrial disorders, or urea cycle deficits] have been sporadically reported in individuals with cyclic vomiting syndrome as well as chromosomal abnormalities. On the other hand, affected persons with cyclic vomiting syndrome as well as those with hyperemesis gravidarum can harbour mutations in single gene(s), which encode for voltage-gated ion channel (e.g., RYR2 or SCN4A genes) or neurotransmitter (e.g., cannabinoid CNR1 or opioid OPMR1 genes) proteins/receptors. Cyclic vomiting syndrome, running through generations, has been sporadically reported. In our personal experience, cyclic vomiting [associated or not with migraines, gastrointestinal motor dysfunction and/or epilepsy], was recorded in two to three and even four generations [Ruggieri et al., unreported data]: interestingly, in all our 5 families CVS was constantly vertically inherited, either in females only or in males only, through generations and segregated independently from other associated genetic conditions [e.g., from neurofibromatosis type 1 in one family]. In our study we have recruited five families with CVS in which we have considered age of onset, maternal or paternal line, association or not with migraines, gastrointestinal motor dysfunction, epilepsy and/or genetic conditions. In these families we have found mitochondrial dysfunction associated to CVS. Mitochondrial dysfunction [i.e., mitochondrial DNA polymorphisms [including A3243G, C16519T and G3010A mtDNA polymorphisms and mutations in the MTTL1 mitochondrial gene (MIM # 590050) or mitochondrial DNA rearrangements or deletions] has been demonstrated in pediatric cyclic vomiting syndrome. The functional significance of these single nucleotide polymorphisms (SNPs) remains unknown. Besides, these mitochondrial associations have not been replicated in adults with cyclic vomiting, thus suggesting the role of other non-mitochondrial factors in adult CVS patients. Inherited inborn errors of metabolism, including fatty acid oxidation disorders, urea cycle defects, mitochondrial and aminoacids disorders have been associated with pediatric CVS. Among the chromosomal disorders, the 18q-syndrome has been anectodically reported in combination with cyclic vomiting syndrome in a girl. Individuals with cyclic vomiting syndrome may also harbour (polymorphic) mutations in single genes, including: (1) RYR2 (ryanodine receptor 2) [MIM # 180902; on chromosome 1q43]; (2) SCN4A (sodium channel voltage-gated, type IV subunit alpha) [MIM # 603967; on chromosome 17q23.3]; (3) CNR1 (cannabinoid receptor 1) [MIM # 114610; on chromosome 6q15]; and (4) OPRM1 (opioid receptor MU1) [MIM # 600018; on chromosome 6q25.2]. The RYR2 gene, encodes for a stress-induced calcium release channel receptor 2, which is part of the ryanodine receptor [RYR: a tetramer composed of 4 RYR2 polypeptides and 4 FK506-binding proteins or FKBP12.6], present in the sarcoplasmic reticulum of: (a) cardiac muscular cells [where it acts as the major source of calcium, required for cardiac muscle excitation-contraction coupling], being responsible for (type 2) right ventricular dysplasia with cardiac arrhythmia type 2 [MIM # 600996] and (type 1) catecholaminergic polymorphous ventricular tachycardia [MIM # 604772] and (b) autonomic and other neurons. Interestingly, mutations in RYR2 have also been recorded in hyperhemesis gravidarum. Marx et al. [2000] demonstrated that protein kinase A [PKA; MIM # 176911; on chromosome 7p22.3] phosphorylation of RYR2 dissociates FKBP12.6 and regulates the channel open probability: in defective hearts RYR2 is PKA hyperphosphorilated, resulting in defective channel function due to increased sensitivity to calcium-induced activation. The SCN4A gene, encodes for a component (i.e., the alpha sub-unit 4) of the voltage gated sodium channel integral membrane protein, which forms a pore in the cytoplasmic membrane conducting sodium ions through the membane and is responsible so far for: (a) a group of related muscular disorders, including hyperkalemic periodic paralysis [HYPP; MIM # 170500], paramyotonia congenita [PMC; MIM # 168300]and (b) a group of disorders classified as potassium-aggravated myotonia [MIM # 608390] and hypokalemic periodic paralysis type 2 [HOKPP2; MIM # 613345]. The CNR1 gene encodes for the G-protein coupled pre-synaptic cannabinoid receptor 1 (CB1), which is expressed in glutamatergic and GABAergic interneurons, located prevalently in the central (e.g., hippocampus, basal ganglia, cerebellum, neo-cortex and spine), peripheral and autonomic (e.g., heart and gut) nervous system but also in the endocrine and sexual glands, and is activated by endocannabinoids acting as a modulator, which in turn decreases the release of glutamate and GABA. Interestingly, the use of cannabinoids is relatively common among individuals with cyclic vomiting syndrome, and chronic cannabis use has been associated paradoxically with cannabinoid hyperemesis syndrome [CHS]. The OPRM1 gene encodes for the -opioid receptor (MOR), which is the primary site of action for the endogenous enkephalins and beta-endorphins, and is located in the pre- and post-synaptic regions of neurons distributed over the brain (e.g., periacqueductal region, dorsal horns of the spine, olfactory bulb and neocortex) and intestinal tract. A proposed genetic-related unifying pathogenic mechanism implies that the synergic roles of these nuclear DNA mutations and single gene sequence variants may result in aberrant stress‐induced calcium release [RYR2-mediated] into the mitochondria, or sodium release/balance [SNN4A-mediated] across the cytoplasmic membrane, or neurotransmitter modulation [e.g., CNR1- or OPRM1-mediated] or axonal transport (KIF1B) or energy production (TRAP1) of autonomic neurons, resulting in an increased risk of developing autonomic/functional disease such as cyclic vomiting, and related conditions such as migraine, epilepsy and gut dysmotility: this model incorporates the existing hypotheses regarding cyclic vomiting syndrome pathogenesis into a cohesive mechanism, and might have treatment implications. Chew and colleagues [2013] expanded a “TUBB3 E410K phenotype” originally known as type 3 congenital fibrosis of the extra-ocular muscles [CFEOM; MIM # 600638; on chromosome 16q24.3], which is secondary to mutations in the TUBB3 [tubulin beta-3; MIM # 602661] gene, which encode for one (i.e., beta-tubulin) of the two heterodimer proteins that compose microtubules by adding, besides congenital fibrosis of the extra-ocular muscles, facial weakness, developmental delay and progressive sensorimotor peripheral neuropathy, Kallmann syndrome [i.e., hypogonadotropic hypogonadism and anosmia; MIM # 308700], stereotyped midface hypoplasia, intellectual disabilities and, in some cases, vocal cord paralysis, tracheomalacia and cyclic vomiting. They inferred that the c.1228G>A mutation in the TUBB3 gene and subsequent E410K aminoacid substitution in the beta-tubulin 3 protein, defines a new genetic aetiology for Moebius syndrome [MIM # 157900], Kallmann syndrome and cyclic vomiting. In the perspective of future research directions larger genetic and functional studies of CVS in both adults and children will be needed to better establish the heritable basis of this disorder. It is critical that these studies involve well-characterized patient sub-sets in order to better delineate genotype-phenotype relationships. To quote an instance, a patient with hypoglycemia-triggered CVS attacks might be more likely to have genetically determined mitochondrial dysfunction than an individual with CVS attacks provoked primarily by psychological stressors.

La sindrome del vomito ciclico viene riportata [MIM # 500007] nel catalogo online delle patologie ad eredità mendeliana nell’uomo [OMIM 2020] ed è attualmente attribuita in questo catalogo a mutazioni nel trasferimento mitocondriale RNA-leucina [MTTL1; MIM # 590050]. Dal punto di vista fenotipico, viene riconosciuto anche un sottogruppo di pazienti con sindrome del vomito ciclico [sindrome del vomito ciclico plus], che hanno disturbi neuromuscolari coesistenti, inclusi ritardo cognitivo, miopatia o disturbi convulsivi. Ulteriori differenze all'interno della sindrome del vomito ciclico, sono state registrate da Lin e colleghi [1999] nella maggioranza (82%) dei loro 214 bambini con CVS che avevano emicranie associate, vomito meno grave e tassi di risposta più elevati alla terapia antiemicranica. Famiglie con CVS che si susseguono in più generazioni sono state segnalate dalla casistica aneddotica Ormai sappiamo che la sindrome del vomito ciclico, l’emicrania, l’epilessia e altri disturbi funzionali della motilità gastrointestinale sono apparentemente alla base di alcune forme di disfunzione mitocondriale. Questa disfunzione, nello squilibrio mitocondriale, potrebbe risultare di base subclinica ma, a seguito di fattori di stress fisiologici, potrebbe essere responsabile di una malattia sistemica acuta. Disturbi ereditari del metabolismo [ad esempio, disturbi dell'ossidazione degli acidi grassi, disturbi mitocondriali o deficit del ciclo dell'urea] sono stati segnalati sporadicamente in individui con sindrome del vomito ciclico, così come anomalie cromosomiche. D'altra parte, le persone affette da sindrome del vomito ciclico e quelle con iperemesi gravidica possono presentare mutazioni in singoli geni, che codificano per il canale ionico voltaggio-dipendente (p. Es., Geni RYR2 o SCN4A) o per proteine/recettori dei neurotrasmettitori (p. Es. Geni CNR1 o oppioidi OPMR1). La sindrome del vomito ciclico trasmessa in più generazioni è stata segnalata sporadicamente. Nella nostra esperienza personale, il vomito ciclico [associato o meno a emicrania, disfunzione motoria gastrointestinale e / o epilessia], è stato registrato in due, tre e anche quattro generazioni [Ruggieri et al., Dati non riportati]: interessante come in tutte le nostre 5 famiglie la CVS è stata costantemente ereditata verticalmente, o solo nelle femmine o solo nei maschi, attraverso le generazioni, e rilevata indipendentemente da altre condizioni genetiche associate [ad esempio, dalla neurofibromatosi di tipo 1 in una famiglia]. Nel nostro studio abbiamo reclutato cinque famiglie con CVS di cui abbiamo considerato l’età di esordio, la linea materna o paterna, l’associazione o meno con l’emicrania, la disfunzione motoria gastrointestinale, l’epilessia e / o le condizioni genetiche. In queste famiglie abbiamo riscontrato una disfunzione mitocondriale associata a CVS. Mutazioni mitocondriali [cioè, polimorfismi del DNA mitocondriale [inclusi i polimorfismi del mtDNA A3243G, C16519T e G3010A e mutazioni nel gene mitocondriale MTTL1 (MIM # 590050) o riarrangiamenti o delezioni del DNA mitocondriale] sono state dimostrate nella sindrome del vomito ciclico in età pediatrica. Il significato funzionale di questi polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) rimane sconosciuto. Inoltre, queste associazioni mitocondriali non sono state replicate negli adulti con vomito ciclico, presupponendo così il ruolo di altri fattori genetici non mitocondriali nei pazienti adulti con CVS. Errori congeniti del metabolismo - errori congeniti ereditari del metabolismo, inclusi disturbi dell'ossidazione degli acidi grassi, difetti del ciclo dell'urea, disturbi mitocondriali e amminoacidi- sono stati associati alla CVS pediatrica. Tra i disturbi cromosomici, è stata segnalata la sindrome 18q- in associazione con la sindrome del vomito ciclico in una ragazza. Gli individui con sindrome da vomito ciclico possono anche ospitare mutazioni (polimorfiche) in singoli geni, tra cui: (1) RYR2 (recettore 2 della rianodina) [MIM # 180902; sul cromosoma 1q43]; (2) SCN4A (canale del sodio voltaggio-dipendente, subunità alfa di tipo IV) [MIM # 603967; sul cromosoma 17q23.3]; (3) CNR1 (recettore 1 dei cannabinoidi) [MIM # 114610; sul cromosoma 6q15]; e (4) OPRM1 (recettore oppioide MU1) [MIM # 600018; sul cromosoma 6q25.2]. Il gene RYR2 codifica di un recettore del canale di rilascio di calcio indotto da stress, che fa parte del recettore della rianodina [RYR: un tetramero composto da 4 polipeptidi RYR2 e 4 proteine leganti FK506 o FKBP12.6] presente nel reticolo sarcoplasmatico di: (a) cellule muscolari cardiache [dove agisce come la principale fonte di calcio, necessaria per l'accoppiamento eccitazione-contrazione del muscolo cardiaco], responsabili di (tipo 2) displasia ventricolare destra con aritmia cardiaca di tipo 2 [MIM # 600996], di (tipo 1) tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica [MIM # 604772] e di (b) neuroni autonomici e altri. È interessante notare che mutazioni in RYR2 sono state registrate anche nell'iperemesi gravidica. Marx et al. [2000] hanno dimostrato che la proteina chinasi A [PKA; MIM # 176911; sul cromosoma 7p22.3] attraverso la fosforilazione di RYR2 dissocia FKBP12.6 e regola la probabilità di apertura del canale: nei cuori difettosi RYR2 è iperfosforilato da PKA, con conseguente funzione alterata del canale a causa dell'aumentata sensibilità all'attivazione indotta dal calcio. Il gene SCN4A codifica un componente (cioè, la subunità alfa 4) della proteina di membrana integrale del canale del sodio con voltaggio dipendente, che forma un poro nella membrana citoplasmatica che conduce gli ioni sodio attraverso la membrana e la sua mutazione è responsabile finora di : (a ) un gruppo di disturbi muscolari correlati, inclusa la paralisi periodica iperkaliemica [HYPP; MIM # 170500], paramiotonia congenita [PMC; MIM # 168300]; e (b) un gruppo di disturbi classificati come miotonia aggravata da potassio [MIM # 608390] e paralisi periodica ipokaliemica di tipo 2 [HOKPP2; MIM # 613345]. Il gene CNR1 codifica del recettore cannabinoide pre-sinaptico accoppiato a proteine G 1 (CB1), espresso negli interneuroni glutammatergici e GABAergici, localizzati prevalentemente nel sistema nervoso centrale (p. Es., Ippocampo, gangli della base, cervelletto, neocorteccia e colonna vertebrale), e nel sistema nervoso periferico e autonomo (p. es., cuore e intestino), ma anche nelle ghiandole endocrine e sessuali, ed è attivato dagli endocannabinoidi che agiscono come un modulatore, che a sua volta diminuisce il rilascio di glutammato e GABA. È interessante notare che l'uso di cannabinoidi è relativamente comune tra gli individui con sindrome del vomito ciclico e l'uso cronico di cannabis è stato associato paradossalmente alla sindrome da iperemesi dei cannabinoidi [CHS]. Il gene OPRM1 codifica del recettore -oppioide (MOR), che è il sito di azione principale per le encefaline e le beta-endorfine endogene, e si trova nelle regioni pre e post-sinaptiche dei neuroni distribuiti nel cervello (es. regione periacqueduttale, corna dorsali della colonna vertebrale, bulbo olfattivo e neocorteccia) e nel tratto intestinale. Un meccanismo patogeno unificante, correlato alla genetica proposta, implica che i ruoli sinergici di queste mutazioni del DNA nucleare e delle varianti di singole sequenze geniche possono provocare un rilascio aberrante di calcio indotto da stress [RYR2-mediato] nei mitocondri, o rilascio / equilibrio di sodio [SNN4A-mediato ] attraverso la membrana citoplasmatica o la modulazione del neurotrasmettitore [p. es., mediata da CNR1 o OPRM1] o il trasporto assonale (KIF1B) o la produzione di energia (TRAP1) dei neuroni autonomici, con conseguente aumento del rischio di sviluppare malattie funzionali come il vomito ciclico e condizioni correlate come emicrania, epilessia e dismotilità intestinale: questo modello incorpora le ipotesi esistenti sulla patogenesi della sindrome del vomito ciclico in un meccanismo coesivo, e potrebbe avere implicazioni terapeutiche. Chew e colleghi [2013] hanno ampliato un "fenotipo TUBB3 E410K" originariamente noto come fibrosi congenita di tipo 3 dei muscoli extra-oculari [CFEOM; MIM # 600638; sul cromosoma 16q24.3], che è secondario a mutazioni nel TUBB3 [tubulina beta-3; MIM # 602661], che codifica per una (cioè, beta-tubulina) delle due proteine eterodimere che compongono i microtubuli, aggiungendo, oltre alla fibrosi congenita dei muscoli extraoculari, debolezza facciale, ritardo dello sviluppo e neuropatia periferica sensomotoria progressiva, Sindrome di Kallmann [cioè, ipogonadismo ipogonadotropo e anosmia; MIM # 308700], ipoplasia medio facciale stereotipata, disabilità intellettiva e, in alcuni casi, paralisi delle corde vocali, tracheomalacia e vomito ciclico. Hanno dedotto che la mutazione c.1228G> A nel gene TUBB3 e la successiva sostituzione dell'amminoacido E410K nella proteina beta-tubulina 3, definisce una nuova eziologia genetica per la sindrome di Moebius [MIM # 157900], la sindrome di Kallmann e il vomito ciclico. Nella prospettiva di indicazioni per ricerche future, saranno necessari studi genetici e funzionali più ampi sulla CVS sia negli adulti che nei bambini per stabilire meglio le basi ereditabili di questo disturbo. È fondamentale che questi studi coinvolgano sottoinsiemi di pazienti ben caratterizzati al fine di delineare meglio le relazioni genotipo-fenotipo. Ad esempio, un paziente con attacchi di CVS, innescati da ipoglicemia, potrebbe avere maggiori probabilità di avere una disfunzione mitocondriale geneticamente determinata rispetto a un individuo con attacchi di CVS provocati principalmente da fattori di stress psicologico.