Design, synthesis and biological evaluation of novel anticancer agents able to target the hBAG3 protein

In questo progetto di Dottorato Industriale sono stati sintetizzati e caratterizzati nuovi agenti antitumorali in grado di inibire le interazioni tra la proteina BAG3 (BCL-2 associated athanogene) e il suo co-chaperone HSP70 (70-kilodalton Heat Shock Protein). BAG3 è un target di enorme rilievo nella ricerca su nuovi chemioterapici in quanto è una proteina sovra-espressa in molti tipi di cellule tumorali e le sue funzioni anti-apoptotiche portano allo sviluppo di farmacoresistenza. Nuovi derivati sono stati progettati e sintetizzati partendo dal composto 1a (Fig. 1), un hit compound riportato in letteratura (Terracciano S. et al. Chem. Comm., 2018, 54, 7613) in grado di legarsi selettivamente al “BAG domain” di BAG3, modulandone l’attività e impedendone l’interazione con HSP70. Al fine di ottimizzare l’affinità di legame per BAG3, sono state introdotte modifiche sia sulle posizioni 5 e 3, sia sul nucleo del 2,4-tiazolidindione: • In posizione 5 il doppio legame è stato sia ridotto che metilato e l’anello catecolico è stato ampiamento esplorato con sistemi aromatici diversamente sostituiti. • In posizione 3 sono stati introdotti sostituenti variamente ingombrati in α al carbonile e la funzione esterea è stata sostituita con ammidi e altri gruppi funzionali come lattoni ed eteri. • Il “core” (2,4-tiazolidindione) è stato sostituito con diversi nuclei, tra cui l’isochinolina, il tiazolo e alcune idantoine. I composti sono stati testati per determinare la loro affinità di legame per BAG3 e la loro citotossicità, da soli e in combinazione con un cocktail di chemioterapici per valutarne i possibili effetti sinergici. Nell’ultima fase del progetto, le informazioni di SAR raccolte sono state sfruttate per la progettazione e la sintesi di tre PROTAC (Proteolysis Targeting Chimera) diretti contro BAG3. I PROTAC sono molecole bivalenti formate da un ligando per la proteina target (BAG3) connesso da un apposito linker ad un ligando per l’E3 ligasi di interesse. Il loro meccanismo d’azione prevede la formazione di un complesso terziario, il quale favorisce l’ubiquitinazione della proteina target e il successivo riconoscimento e degradazione da parte del proteasoma. In mancanza di una struttura cristallina a raggi X del BAG3 umano, gli studi SAR ottenuti in questo progetto sono stati utilizzati per scegliere il punto di attacco del linker mentre come ligasi sono state selezionate Von Hippel-Lindau (VHL) e Cereblon (CRBN) in quanto spesso trovate sovra-espresse nelle cellule tumorali.

The main objective of this PhD thesis is to target BAG3 (BCL-2 associated athanogene) and prevent its protein-protein interactions (PPIs) with HSP70 (70-kilodalton Heat Shock Protein). BAG3 is a protein overexpressed in many tumor cells, whose anti-apoptotic functions lead to the development of drug resistance. A strategy to prevent the HSP70-BAG3 PPIs is the development of high-affinity small molecule BAG3 modulators. New derivatives were designed and synthesized starting from compound 1a (Fig. 1), a hit compound reported in the literature (Terracciano et al. Chem. Comm., 2018, 54, 7613) that is able to bind the “BAG domain” of BAG3, modulating its activity and preventing its PPIs with HSP70. In order to optimize the binding affinity for BAG3, modifications have been introduced on the 3- and 5- positions of the 2,4-thiazolidinedione core: • At position 5 the double bond has been both reduced and methylated and the catechol ring has been extensively explored with differently substituted aromatic systems. • At position 3 variously hindered substituents were introduced in the α position of the carbonyl and the ester function was replaced with amides and other functional groups such as lactones and ethers. Finally, the 2,4-thiazolidinedione core has been replaced with various nuclei, including isoquinoline, thiazole and some hydantoins. The compounds synthesized were tested for their BAG3 binding affinity and antiproliferative activity. As BAG3 overexpression is involved in apoptosis escape, it was hypothesized that these compounds could be used also in combination with established anticancer drugs to overcome the drug resistance phenomena in resistant cancer cells and to improve their cytotoxicity with a synergistic effect. The second objective of this PhD thesis is to design and synthesize PROTACs able to form effective ternary complexes with the target protein (BAG3) and an E3 ubiquitin ligase, which lead to the ubiquitination and degradation of BAG3. Lacking an X-ray crystal structure of human BAG3, SAR studies around this 2,4-thiazolidinedione performed in the initial part of the project were used to formulate hypotheses of appropriate regions for linker attachment. Among the most used E3 ubiquitin ligases, Cereblon (CRBN) and Von Hippel-Lindau (VHL) were selected because they are frequently found to be overexpressed in different tumor types.