P2X7R:role in the generation of an ATP-rich TME driven by nutrient deprivation

L’ ATP extracellulare, uno dei maggiori componenti del microambiente tumorale, svolge un ruolo fondamentale sia nell’attivazione dell’immunità anti-tumorale che nell’attività immunosoppressiva. La restrizione calorica si è rivelata un mezzo efficace per migliorare l’effetto delle terapie anti-tumorali, grazie alla sua capacità di incrementare la concentrazione di ATP nel microambiente tumorale. La somministrazione in vivo di idrossicitrato, un composto naturale che mima la restrizione calorica, riduce significativamente la dimensione della massa tumorale di melanoma B16F10 e causa l’aumento dei livelli di ATP nel microambiente tumorale. Abbiamo ricreato la restrizione calorica in vitro mantenendo le cellule di melanoma murino in assenza di nutrienti (serum starvation). La deprivazione cronica di nutrienti riduce significativamente la proliferazione cellulare e determina un aumento significativo dei livelli di ATP extracellulare, in assenza di segni evidenti di sofferenza o morte cellulare. L’ATP è il principale ligando del recettore P2X7, un importante recettore purinergico coinvolto nella regolazione della proliferazione e morte cellulare. La deprivazione di nutrienti riduce notevolmente la funzionalità del recettore P2X7 anche se l’espressione proteica di quest’ultimo resta invariata. I livelli di calcio e di ATP intracellulari sono inoltre significativamente ridotti e il metabolismo energetico profondamente compromesso. Nelle cellule mantenute in assenza di nutrienti, i mitocondri appaiono frammentati e depolarizzati, la fosforilazione ossidativa è significativamente inibita e i complessi I e II della catena respiratoria sono down-regolati. In parallelo la glicolisi aerobia e il rilascio di lattato risultano aumentati. Le cellule di melanoma rilasciano esosomi/microparticelle, comunemente denominati vescicole extracellulari (EVs). Abbiamo dimostrato che le cellule di melanoma mantenute in assenza di nutrienti rilasciano una quantità di vescicole maggiore rispetto a quella liberata dalle cellule mantenute in normali condizioni colturali. Queste vescicole contengono un’elevata concentrazione di ATP e mitocondri. Inoltre, il silenziamento del recettore P2X7 riduce significativamente la quantità di vescicole e di ATP extracellulare liberati, suggerendo che un efficiente meccanismo di rilascio di ATP richieda l’espressione del recettore P2X7. I dati ottenuti suggeriscono che la deprivazione di nutrienti causi un alterazione del metabolismo energetico tumorale e che il recettore P2X7 sia coinvolto nella formazione di un microambiente tumorale ricco di ATP guidata dalla deprivazione di nutrienti.

Extracellular ATP, one of the major constituent of the tumor microenvironment (TME), promotes immunosuppression or anti-tumor immunity. It has been shown that caloric restriction improves the efficacy of anti-cancer therapy by increasing the ATP concentration in the TME. In vivo administration of the caloric restriction mimetic (CRM) hydroxycitrate reduced B16F10 melanoma tumor size and at the same time increased the ATP levels in the TME. We mimicked the in vivo CRM activity by in vitro exposing melanoma cells to serum starvation. Chronic incubation in the absence of serum inhibited melanoma cell growth and increased the extracellular ATP concentration in the absence of autophagy or cell death. The P2X7 receptor (P2X7R) is a main sensor of extracellular ATP and a promoter of cell proliferation or cell death depending on the level of activation. Serum starvation severely affected P2X7R-dependent responses, despite P2X7R expression was unchanged. Cytoplasmic Ca2+ levels and intracellular ATP concentration were strikingly reduced in serum-starved versus serum-supplemented cells. In the absence of serum, mitochondria were fragmented and depolarized, oxidative phosphorylation was dramatically impaired and Complex I and II of the mitochondrial respiratory chain were down-regulated. In parallel glycolysis and release of lactic acid were increased. Melanoma cells are known to release exosomes/microparticles, collectively referred to as extracellular vesicles (EVs). We show that serum-starved cells released a higher amount of EVs compared to serum-supplemented cells. EVs contained a high amount of ATP as well as mitochondria. Moreover P2X7R silencing reduced EV and extracellular ATP release, suggesting that an efficient ATP release mechanism required functional P2X7R expression. Our findings suggest that serum starvation causes an impairment of cancer cell metabolism and support a role for the P2X7R in the mechanism by which nutrient deprivation drives the establishment of an ATP-rich tumor microenvironment