Epigenetic analyses indicate a role of asbestos fibers in the dysregulation of miR-197-3p in sera of pleural mesothelioma patients and workers ex-exposed to this oncogenic mineral

I microRNA (miRNA) sono regolatori chiave in diverse condizioni sia fisiologiche che patologiche. Infatti, sono indicati come potenziali biomarcatori e bersagli terapeutici in diversi tipi di cancro, tra cui il mesotelioma pleurico (MP), un tumore letale strettamente legato all'esposizione all'amianto. Il MP, caratterizzato da una diagnosi tardiva e da opzioni terapeutiche limitate, richiede approcci innovativi per una gestione efficace. Lo scopo di questo studio è stato quello di verificare se il miR-197-3p potesse essere un biomarcatore del MP. Per questo scopo, sono state utilizzate la Real-Time qPCR (RT-qPCR) e la digital droplet PCR (ddPCR), unitamente ad esperimenti funzionali per studiare le interazioni del miR-197-3p. Le analisi hanno mostrato che il miR-197-3p è significativamente sottoespresso 1,7 e 2,1 volte nei sieri dei WEA rispetto ai HS, rispettivamente mediante RT-qPCR e ddPCR. Considerando che l'esposizione all'amianto riguarda circa l'80% dei pazienti affetti da MP, i WEA sono stati impiegati come gruppo di controllo rispetto ai MP. Le analisi hanno mostrato una sovraespressione di 1,8 e 1,9 volte del miR-197-3p nei sieri di MP rispetto ai WEA. Inoltre, è emersa una correlazione inversa tra esposizione cumulativa all'amianto e espressione del miR-197-3p nei WEA. Questi dati suggeriscono di impiegare il miR-197-3p come marker durante lo screening/follow-up di soggetti ad alto rischio, come i WEA, con un test sui sieri non invasivo di facile valutazione da integrare con altri biomarcatori specifici e parametri clinici. Gli studi in vitro hanno confermato una sovraespressione del miR-197-3p nelle cellule di MP rispetto alle cellule mesoteliali. Esperimenti funzionali, con antagomiR e mimic, hanno evidenziato un ruolo significativo del miR-197-3p nella modulazione della proliferazione. In particolare, il saggio di formazione delle colonie ha mostrato una significativa riduzione della proliferazione nelle cellule trasfettate con l’antagomiR e un significativo aumento nelle cellule trasfettate con il mimic rispetto ai controlli. Le analisi di vitalità, apoptosi e migrazione cellulare non hanno mostrato differenze. Le analisi bioinformatiche avevano evidenziato la proteina p120 tra i diversi target di miRNA 197-3p. Studi funzionali hanno identificato una significativa sovraespressione dell’mRNA di p120 nelle cellule trasfettate con antagomiR rispetto al controllo, indicando un possibile legame tra miR-197-3p e p120. In contrasto con queste osservazioni, i dati ottenuti con il western blot non hanno mostrato cambiamenti significativi nella proteina p120 dopo la trasfezione. Ulteriori indagini sul meccanismo d'azione del miR-197-3p hanno rivelato un'interazione inaspettata tra il miR-197-3p e il TGF-β1, un fattore chiave nella progressione. In particolare, l'mRNA di TGF-β1 è risultato significativamente aumentato nelle cellule trasfettate con l'antagomiR rispetto ai controlli. Analisi aggiuntive hanno evidenziato la presenza di due regioni complementari all'interno del 3'-UTR dell'mRNA del TGF-β1 che presentano una sequenza complementare alla regione seme del miR-197-3p, a sostegno delle osservazioni precedenti. Tuttavia, la successiva analisi in western blot non ha mostrato cambiamenti significativi nell'espressione della proteina TGF-β1 dopo la trasfezione. Considerando il coinvolgimento ben documentato del miR-197-3p nelle vie infiammatorie, sarebbe allettante ipotizzare che il miR-197-3p interagisca con il TGF-β1, una citochina chiave nei processi tumorali, contribuendo al fine controllo del microambiente tumorale (TME). Tuttavia il meccanismo di questa interazione rimane ancora da chiarire. Nel complesso, questo studio rivela i molteplici ruoli del miR-197-3p nel MP, indicando un suo potenziale uso come marcatore circolante per una diagnosi precoce della malattia in soggetti ad alto rischio, e sottolinea la complessità della regolazione genica mediata dal miR-197-3p nel MP.

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as key regulators in different physiological and pathological conditions. In tumors, they have been proposed as potential biomarkers and therapeutic targets within different types of cancer, including pleural mesothelioma (PM), a lethal neoplasia closely linked to asbestos exposure. PM, characterized by a late-stage diagnosis and limited therapeutic options, demands innovative approaches for effective management. The aim of this study was to validate miR-197-3p as an early PM biomarker, using Real-Time qPCR (RT-qPCR) and digital droplet PCR (ddPCR), and to investigate its interactions through functionality experiments. Significantly, MiR-197-3p tested 1.7- and 2.1-fold down-regulated in WEA sera compared to HS, employing RT-qPCR and ddPCR, respectively. Since asbestos exposure affects about 80% of PM patients, the WEA group was selected as the most relevant control for PM. MiR-197-3p, by using the same two PCR techniques, tested 1.8- and 1.9-fold up-regulated in PM compared to WEA sera. Furthermore, our investigation allowed to verify a significant decrease of miR-197-3p expression in sera of WEA with a higher cumulative asbestos exposure, showing an inverse correlation between the expression of this miRNA and the oncogenic mineral load. Our data indicate that miR-197-3p could be a promising marker to be use as a screening parameter in high-risk individuals, such as WEA, offering an easy-to-evaluate noninvasive test to be complemented by other specific biomarkers/clinical parameters. Additional in vitro studies revealed a significant up-regulation of miR-197-3p in PM cell lines and primary cells compared to human mesothelial cells (HMC). Gain- and loss-of-function experiments, using miR-197-3p antagomiR and mimic, showed that miR-197-3p is significantly involved in the modulation of proliferation. Specifically, the colony formation assay showed a significant down-regulation of cell proliferation within antagomiR-transfected and a significant increase in mimic-transfected cells compared to controls. Assays on the cell viability, apoptosis, and cell migration did no show differences. Among the different targets emerged from bioinformatics analysis, functional studies identified a significant upregulation of p120 mRNA within antagomiR transfected cells compared to the control, indicating a possible link between miR-197-3p and p120. In contrast with these observations, data obtained by western blot showed no significant change within p120 protein after mimic/antagomiR transfection. Additional investigations on miR-197-3p mechanism of action revealed an unexpected interaction between miR-197-3p and Transforming Growth Factor-beta 1 (TGF-β1), a key player in the cell progression. Specifically, TGF-β1 mRNA was significantly upregulated in the antagomiR-transfected cells compared to controls. Further analysis highlighted the presence of two complementary regions within the 3'-UTR of TGF-β1 mRNA that exhibit a complementary sequence to the seed region of miR-197-3p. This result is in agreement with previous reports. Nevertheless, subsequent western blot analysis showed no significant changes in TGF-β1 protein expression after mimic/antagomiR transfection. Considering the well documented involvement of miR-197-3p within inflammatory pathways, it would be tempting to speculate that miR-197-3p interacts with TGF-β1, a key cytokine in tumor processes, contributing to the fine control of PM tumor microenvironment (TME). However, although fascinating, the mechanism behind this interaction remains to be elucidated. Taken together, this study reveals the multiple roles of miR-197-3p in PM, indicating its diagnostic potential as a circulating marker for an early detection of the disease in high-risk individuals, and underscores the complexity of miR-197-3p-mediated gene regulation in PM.