Genomica strutturale e funzionale del miR-671 e del suo gene ospite CHPF2: potenziale coinvolgimento patogenetico nel Glioblastoma Multiforme

Il 52.1% dei geni codificanti i microRNA (geni miRNA) è situato in regioni intergeniche del genoma umano, il 42.6% ricade all interno di introni di geni codificanti proteine, mentre soltanto il 5.3% è localizzato negli esoni di questi geni. Effettuando una ricerca sulla localizzazione genomica dei geni miRNA umani nel database miRBase, la nostra attenzione si è focalizzata sull hsa-premiR-671, la cui sequenza codificante sembra essere contenuta all interno del quarto esone del gene della 2° classe CHPF2 (Chondroitin Sulfate Glucoronyltransferase2, CSGLCA-T), che codifica la proteina omonima. Il segmento codificante il premiR-671 (lungo 118 nucleotidi) si estende dalla posizione 3572 alla 3690, all interno della porzione codificante del quarto esone di CHPF2; le coordinate genomiche del premiR-671 sono reperibili in miRBase (chr. 7q36.1, nt. 7: 150935507-150935624 [+]) e fanno riferimento alla sequenza del genoma umano depositata in ENSEMBL (Assembly GRCh37.p5). Attraverso l analisi di Expressed Sequence Tags (ESTs) abbiamo identificato quattro diverse isoforme di mRNA codificate dal gene CHPF2 (Long1, Long2, Short, Monoexonic) ed abbiamo validato sperimentalmente due di queste varianti trascrizionali: Short (mediante PCR semiquantitativa e sequenziamento) e Monoexonic (mediante Real Time PCR). L espressione di CHPF2 e dei miR-671-5p e miR-671-3p è stata analizzata mediante un pannello di diciannove differenti organi e tessuti ed ha evidenziato una tendenziale anticorrelazione tra la variante trascrizionale Long2 di CHPF2 ed il miR-671-3p. Mediante modulazione in vitro del pre-miR-671-3p e dell anti-miR-671-3p in cellule di Glioblastoma U87MG abbiamo confermato questo rapporto, sia a livello del trascritto che della proteina. Il gene CHPF2, assieme a quelli codificanti i miR-671-5p e miR-671-3p contenuti al suo interno, è localizzato nella regione q36.1 del cromosoma umano 7. Questa regione è soggetta a frequenti alterazioni strutturali di tipo gain in diverse neoplasie. Utilizzando l approccio del gene candidato posizionale, abbiamo identificato e caratterizzato alterazioni della struttura e della espressione di CHPF2 nel Glioblastoma Multiforme (GBM), un tumore maligno costituito da cellule di origine gliale e caratterizzato da riarrangiamenti strutturali della regione 7q36.1. Nelle ventinove biopsie GBM analizzate abbiamo rilevato una sottoespressione di CHPF2 rispetto ad un controllo normale (PC1). Anche i miR-671-5p ed 671-3p sono sottoespressi nelle stesse biopsie; in particolare, abbiamo dimostrato che la modulazione negativa del miR-671-3p è quantitativamente omogenea in tutte le biopsie analizzate. L analisi del profilo di metilazione di CHPF2, miR-671-5p e miR-671-3p nel GBM è stata effettuata in campioni paraffinati di alcune delle ventinove biopsie GBM citate in precedenza, ma non ha evidenziato l esistenza di metilazione nel locus CHPF2. Lo studio dei targets predetti del miR-671-5p, del miR-671-3p e delle relative networks biologiche ha consentito di identificare diverse pathways, correlate al processo neoplastico e potenzialmente regolate dai due miRNA. L ulteriore studio di questi fenomeni dovrebbe contribuire a chiarire ulteriormente le basi molecolari del GBM e confermare il coinvolgimento patogenetico dei miR-671-5p e miR-671-3p in questa neoplasia. Il nostro gruppo si propone di verificare sperimentalmente se: (1) il tratto genomico codificante i miR-671-5p e miR-671-3p sia deleto nelle biopsie GBM analizzate; (2) se il gene CHPF2, ed in particolare le sue isoforme mRNA Long 1 e Long 2, possano essere considerate targets dei miR-671-3p e miR-671-5p: per questa indagine verrà utilizzato il test della luciferasi. Se questa ipotesi dovesse essere confermata, intendiamo verificare tramite mutagenesi sito-specifica se la coding sequence di CHPF2 sia la regione di effettivo targeting.