Ruolo della Lipocalina Associata alla Gelatinasi dei Neutrofili (NGAL) come Target Terapeutico nei Tumori Urologici

Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) positively modulates the activity of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) through a protein-protein interaction, resulting in the formation of the NGAL/MMP-9 complex. This complex is stabilized by a disulfide bond between the Cysteine 107 (Cys107) of NGAL and one of the available cysteines of MMP-9. By binding NGAL, MMP-9 is also protected from degradation. NGAL and MMP-9 play a key role in the degradation of the extracellular matrix (ECM), promoting metastasis formation. The role of NGAL, MMP-9 and of the NGAL/MMP-9 complex has been investigated in several cancers of the urinary tract, including bladder cancer, kidney cancer and prostate cancer. We have previously demonstrated that the TP53 mutation and NF-kB over-expression lead to NGAL over-expression in advanced prostate cancer cells. In particular, we found that NGAL over-expression in the prostate cancer cell lines that express low NGAL basal levels (22Rv-1 and LNCaP) is associated to enhanced tumor cell growth in soft agar assay. Conversely, NGAL silencing induced in the PC3 and DU145 cells, that over-express NGAL, results in a lower growth rate. These results prompted us to investigate the interaction mechanisms between NGAL and MMP-9 putatively responsible for the enhancement of MMP-9 proteolytic activity and, in turn, for the aggressiveness of cancer cells. In particular, the functional effect of disulfide bond depletion in the stability of the NGAL/MMP-9 complex was evaluated through the modification of Cys107 obtained by the substitution of the cysteine residue with a glycine (NGALC107G). We demonstrated that the clones co-transfected with plasmids coding for MMP-9 and NGAL show higher MMP-9 protein levels than those transfected with the plasmid for MMP-9 alone. In addition, there are no differences in cells co-transfected with NGALWT vs. NGALC107G plasmid. Moreover, the invasion assay has shown that cells overexpressing MMP-9 have a higher invasive capacity as compared to controls (cells transfected with empty plasmid) and that cells transfected with NGALWT are more aggressive than cells transfected with NGALC107G and controls. Taken together, the results show that NGAL over-expression enhances cells invasion independently and through the modulation of MMP-9 activity. Furthermore, the induced NGALC107G mutation and the disulfide bond depletion did not appear necessary for the activation of MMP-9, thus suggesting that this activation may be mediated by other interaction mechanisms between NGAL and MMP-9 not yet identified. Considering that the inhibition of NGAL, MMP-9 or the complex NGAL/MMP-9 may result in decreased cancer cell growth and invasiveness, the possible use of tailored-targeted therapeutic strategies in metastatic patients seems to be promising. Further studies are warranted in order to better characterize and target the interaction mechanisms between NGAL and MMP-9 and to test NGAL-MMP9-targeted cancer therapy, both in preclinical models and in clinical trials.

La lipocalina associata alla gelatinasi dei neutrofili (NGAL) modula positivamente l'attività della metalloproteinasi della matrice-9 (MMP-9) attraverso un'interazione proteina-proteina con la conseguente formazione del complesso NGAL/MMP-9. Questo complesso è stabilizzato da un legame disolfuro tra la cisteina 107 (Cys107) di NGAL e una delle cisteine disponibili di MMP-9. Inoltre, il legame con NGAL protegge MMP-9 dalla degradazione. NGAL e MMP-9 sono svolgono un ruolo cruciale nella degradazione della matrice extracellulare, promuovendo la formazione delle metastasi. Il ruolo di NGAL, di MMP-9 e del complesso NGAL/MMP-9 è stato studiato in diversi tumori del tratto urinario, tra cui il tumore della vescica, del rene e della prostata. Abbiamo precedentemente dimostrato che la mutazione TP53 e la sovraespressione di NF-kB portano alla sovraespressione di NGAL in linee cellulari di carcinoma della prostata avanzato. In particolare, è stato dimostrato che la sovraespressione di NGAL nelle linee cellulari di carcinoma prostatico che esprimono bassi livelli basali di NGAL (22Rv-1 e LNCaP) aumenta la crescita delle cellule tumorali in saggi di proliferazione in soft agar. Al contrario, il silenziamento di NGAL indotto nelle cellule PC3 e DU145, che sovraesprimono NGAL, determina un tasso di crescita inferiore. Questi risultati ci hanno spinto a studiare i meccanismi di interazione tra NGAL e MMP-9 responsabili dell’aumento dell'attività proteolitica di MMP-9 e conseguentemente dell'aggressività delle cellule tumorali. In particolare, l'effetto funzionale della rimozione del legame disolfuro nella stabilità del complesso NGAL/MMP-9 è stato valutato attraverso la modifica di Cys107 ottenuta tramite la sostituzione del residuo di cisteina con una glicina (NGALC107G). Abbiamo dimostrato che i cloni co-trasfettati con plasmidi codificanti per MMP-9 ed NGAL presentano livelli proteici di MMP-9 più alti rispetto ai cloni trasfettati con il solo plasmide per MMP-9. Inoltre non si riscontrano differenze quando si co-trasfettano le cellule con plasmidi codificanti per NGALWT o NGALC107G. Il saggio di invasività ha mostrato che le cellule che overesprimono MMP-9 hanno un potere invasivo più elevato rispetto ai controlli (cellule trasfettate con il plasmide vuoto) e che le cellule trasfettate con NGALWT sono più aggressive di quelle trasfettate con NGALC107G e dei controlli. Complessivamente, abbiamo dimostrato che la sovraespressione di NGAL aumenta l'invasività delle cellule sia indipendentemente che attraverso la modulazione dell'attività di MMP-9. Inoltre, la mutazione NGALC107G e la rimozione del legame disolfuro non sembrano essere necessari per l'attivazione di MMP-9. Pertanto questa attivazione potrebbe essere mediata da altri meccanismi di interazione tra NGAL e MMP-9 non ancora identificati. Considerato che l'inibizione di NGAL, di MMP-9 o del complesso NGAL/MMP-9 potrebbe comportare una diminuzione della crescita e dell'invasione delle cellule tumorali, sembra promettente l’utilizzo di nuove strategie terapeutiche mirate, come terapia complementare nei pazienti metastatici. Ulteriori studi sono necessari per meglio caratterizzare e identificare i meccanismi di interazione tra NGAL e MMP-9 e per valutare il possibile utilizzo di strategie terapeutiche innovative mirate, sia in modelli preclinici che in studi clinici.