Espressione genica e Profilo Fosfoproteomico nella Malattia del Trapianto contro l'Ospite in bambini sottoposti a trapianto di cellule staminali ematopoietiche: confronto tra forma acuta e forma cronica

The major complication of Haemopoietic Stem Cell Transplantation (HSCT) is the Graft versus-Host Disease (GvHD), an immunological disorder that affects many organs (gut, liver, skin, lungs). GvHD arises in the immunocompromised recipient when donor T cells respond to genetically different proteins on host cells. Clinically Consensus Conference of the National Institute of Health (NIH classification) established new criteria to define acute from chronic GvHD. Although the pathogenesis of acute GvHD is well defined, the biological mechanisms that contribute to the insurgence of chronic GvHD are still not well characterized. There is no evidence of reliable biomarkers for chronic GvHD and this makes difficult both the diagnosis and the therapy handling. As well known, clinical manifestations of chronic GvHD are similar to autoimmune diseases (sclerodermia, Sjogren syndrome, psoriasis, chronic inflammatory bowel diseases). Therefore, in order to identify new potential biomarkers for chronic GvHD, main aim of this thesis is studying such molecular pathway involved in autoimmune diseases in allogeneic HSCT pediatric patients affected to chronic GvHD. We performed a retrospective study analyzing the peripheral blood of 29 pediatric patients subjected to allo-HSCT between 1995 and 2012 at the Pediatric Hematopoietic Stem Cell Transplantation Unit of Padova. We included 11 patients with acute GvHD (13 patients with NIH criteria), 14 patients with chronic GVHD after acute GvHD (12 patients with NIH criteria) and 4 patients did not develop GvHD. Cytokine gene expression analysis was performed by means of Sybr Green Real Time Quantitative PCR, in order to study the main autoimmune cytokines expression. Moreover we performed a phosphoproteomic analysis by Reverse Phase Protein Arrays in order to study the activation state of signal transduction pathways. By means of gene expression analysis we found that IL22 is expressed in chronic GvHD patients more than in patients in complete remission (p value 0,02), patients with acute GvHD and patients who did not developed GvHD. Moreover, also IL17 tends to be more expressed in chronic GvHD patients even if not as much as IL22. We obtained these results stratifying patients both with the old criteria and the new NIH classification. The complete immunophenotype data were not available for these patients, thus we could not define which cellular subpopulation could be responsible of the increased IL22 expression between Natural Killer (NK), T helper 17 (Th17), T helper 1 (Th1) and T helper 22 (Th22) cells. We tried to relate the IL22 expression with the presence of NK cells, but we did not find any correlation, although we did not study their activation state. Moreover, we searched for a correlation between IL22 and IL17 expression and we found that they are positively correlated (rho: 0,7). Phosphoproteomic profiling analysis showed that proteins involved in IL22 production in Th17 cells (JAK2, STAT3 and TYK2), tends to be expressed in chronic GvHD patients diagnosed by NIH criteria more than more than in patients in complete remission. IL22 could be thus considered as a new potential biomarker of active chronic GvHD. Positive correlation with IL17 gene expression and JAK2, STAT3 and TYK2 tendency to be activated in NIH classified chronic GVHD patients suggest a possible role for Th17 cells in IL22 production in chronic GvHD. We can not exclude a contribution of Th1 and Th22 cells. In order to validate this data we plan to increase the number of patients, to measure plasmatic levels of IL22 and to evaluate the distribution of Th1, Th17 and Th22 subpopulations after allo-HSCT, as well as to study activate state of NK cells. Moreover, it will be interesting to study the activation state of the signal transduction pathways downstream the IL22 receptor in cGvHD tissue biopsies.

La malattia del trapianto contro l’ospite (Graft versus Host Disease, GvHD), principale complicanza del trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (alloTCSE), è un disordine immunologico scatenato dai linfociti T del donatore contro gli alloantigeni del ricevente; la gravità dipende dalle differenze HLA tra donatore e ricevente, con interessamento di diversi organi (cute, tratto gastrointestinale, fegato, polmoni). Si distinguono la forma acuta e cronica (aGvHD, cGvHD). Le conoscenze sulla patogenesi della forma acuta sono meglio conosciute rispetto a quelle sulla cGvHD, in cui diagnosi e gestione terapeutica rappresentano uno dei maggiori problemi post allo-TCSE. Non esistono ancora marcatori biologici in grado di permettere una distinzione tra le due forme. Clinicamente la forma cronica presenta manifestazioni simili alle malattie autoimmuni (sclerodermia, sindrome di Sijogren, psoriasi, malattie infiammatorie croniche intestinali). Sulla base di questa osservazione, scopo di questo studio è stato quello di analizzare retrospettivamente l’espressione di marcatori biologici in parte già noti nelle patologie autoimmuni, in 29 pazienti pediatrici sottoposti ad allo TCSE nel periodo dal 1995 al gennaio 2012 presso l’Unità Trapianti della Clinica di Oncoematologia di Padova che hanno o meno sviluppato GvHD. Secondo la vecchia classificazione temporale e successiva revisione secondo il National Institute of Health (NIH) sono stati inclusi pazienti con aGvHD (vecchia classificazione: 11 pazienti; NIH 2005: 13 pazienti), con cGvHD preceduta dalla forma acuta (vecchia classificazione: 14 pazienti; NIH 2005: 12 pazienti), pazienti che non avevano sviluppato GvHD (4 pazienti). Sono state eseguite analisi di espressione genica di citochine mediante Sybr Green Real Time Quantitative PCR (RQ PCR) e studio del profilo fosfoproteomico delle proteine coinvolte nelle principali vie di trasduzione del segnale, proliferazione e attivazione delle cellule B e T e nell’infiammazione mediante Reverse Phase Protein Array (RPPA). In RQ PCR l'IL22 è risultata essere maggiormente espressa nei pazienti con cGvHD in fase attiva rispetto agli altri pazienti (p value 0,02). Per mancanza di dati completi riguardanti la caratterizzazione immunofenotipica dei pazienti analizzati, non è stato possibile attribuire l’aumentata produzione di IL22 a nessun sottotipo cellulare specifico. Avendo a disposizione dati precedentemente raccolti sul numero di cellule Natural Killer (NK), non è stata osservata correlazione con l’espressione di IL22, sebbene non sia possibile escludere un possibile ruolo delle NK non avendone studiato lo stato di attivazione. Nell’ipotesi di un possibile ruolo delle Th17, è stata osservata correlazione tra espressione genica di IL22 e quella di IL17 (rho: 0,7); tale dato è stato avvalorato dallo studio di fosfoproteomica relativo all’espressione delle proteine coinvolte nel pathway di espressione dell’IL22 nelle Th17 (JAK2, STAT3 e TYK2): dopo rivalutazione dei pazienti secondo i nuovi criteri NIH del 2005 è stata osservata una tendenza della loro maggiore espressione nel gruppo di pazienti con cGvHD in fase attiva rispetto ai pazienti in remissione completa. Le Th17 potrebbero essere implicate nell’aumento dell’espressione dell’IL22, sebbene possano essere coinvolte anche altre popolazioni (Th1, Th22). L’IL22 potrebbe rappresentare un potenziale marker di stato attivo di cGvHD. Al fine di valicare i dati ottenuti sarà necessario: 1) aumentare la casistica, 2) dosare i livelli plasmatici di IL22, 3) valutare la presenza delle sottopopolazioni Th1, Th17 e Th22, nonché studiare lo stato di attivazione delle NK ai vari timepoint considerati post allo TCSE. Sarà infine interessante studiare l’attivazione dei pathway a valle del recettore dell’IL22 nelle biopsie dei tessuti interessati dalla cGvHD.