EFFETTI PROTETTIVI DELLA TIMOSINA-beta4 IN UN MODELLO MURINO DI DANNO POLMONARE DA BLEOMICINA

PROTECTIVE EFFECTS OF THYMOSIN-beta4 IN A MURINE MODEL OF BLEOMYCIN-INDUCED LUNG DAMAGE. Background. Thymosin-beta4 is a little protein firstly isolated in the thymus by Goldstain and colleagues. Thymosin-beta4 is the most abundant member of beta-Thymosin family. Thymosin-beta 4 exerts pleiotropic biological activities and the different functions are attributed to peptides producted from endoproteinase activity, such as the fragment Ac-SDKP. Many studies attribute to Ac-SDKP a anti-inflammatory propriety and to a oxidized form of Thymosin-beta4, (Thymosin-beta 4-sulfoxide) a anti-oxidative propriety. Moreover, Thymosin-beta 4 treatment prevented profibrotic gene expression in cardiac cells in vitro and in vivo. Thymosin-beta 4 was recently found at high concentration in the brocho alveolar lavage (BAL) of scleroderma patients with lung involvement. It has been hypothesized that Thymosin-beta 4 may exert a cyto-protective effect during lung injury as lower levels of Thymosin-Beta 4 were associated to a worse lung interstitial disease progression. Aim of this Thesis was to study the putative protective effects of Thymosin-beta 4 in a well known murine model of Blemycin-induced lung damage. These effects would be extremely useful to slow the early stage of fibrotic process, where ROS and inflammatory tissue damage take actively part in the fibrotic phenotype expression. Materials and Methods. In this study C57BL/6 mice were treated with bleomycin (BLEO 1 mg/Kg) in the absence or presence of Thymosin-beta 4 (6 mg/kg, delivered intra-peritoneally on the day of BLEO treatment and for two additional doses). After the sacrifice one week later, we performed: a) measurement of total fluid and collagen content in the lung; b)BALF analysis; c) myeloperoxidase activity assay; d) lung histology and IHC; e)FACS analysis of blood and spleen T cells for detecting IL-17A, CD4, CD25 and Fox-p3 antigens. Results. Compared to BLEO-treated mice, Thymosin-beta 4 co-traeted mice did not lose a much weight and had a higher survival rate. Moreover, BLEO-induced inflammation and lung damage were substantially reduced by Thymosin-beta 4 treatment, as demonstrated by the significant reduction of edema, total collagen content, lung infiltration by leucocytes, myeloperxidase activity in lung homogenates, and histological evidence of lung damage. Results of IHC show a strong reactivity for Thymosin-beta 4 in lung tissue of Thymosin-beta 4 co-treated mice, showing alveolar localization. FACS analysis show a reduced percentage of Th17 and gamma delta T cells as well as an increase in CD4, CD25, Fox-p3 positive T cells, in Thymosin-beta4 co-treated mice compared to BLEO-treated mice. Conclusion. This report shows a wide protective role of Thymosin-beta 4 in the murine model of Bleomycin-induceded lung damage. Further studies are needed to evaluate putative long-lasting protective effects of Thymosin-beta 4 and its possible therapeutic role. In particular, one will needs to optimize the dosing amounts, dosing schedule and administration.

EFFETTI PROTETTIVI DELLA TIMOSINA-beta4 IN UN MODELLO MURINO DI DANNO POLMONARE DA BLEOMICINA Background. La Timosina-beta4, isolata dal timo per la prima volta da Goldstain e collaboratori. nel 1966, è il membro più abbondante della famiglia delle beta-Timosine e risulta la principale proteina sequestrante l actina nella cellula. Ha attività biologica pleiotropica e le varie funzioni sono attribuite a particolari siti attivi contenuti nei peptidi prodotti da attività endoproteinasiche, come ad esempio nel frammento Ac-SDKP. Molti studi attribuiscono ad Ac-SDKP potere antinfiammatorio e alla forma ossidata della Timosina-beta4 (Timosina-beta4-sulfoxide) potere antiossidante. Inoltre, il trattamento di cellule cardiache con la Timosina-beta4 impedisce l espressione di geni profibrotici sia in vitro che in vivo. In un recente studio sono state descritte elevate concentrazioni di beta-Timosine (Timosina-beta4, Timosina-beta4-sulfoxide, Timosina-beta10) nel BAL di una coorte di soggetti con sclerodermia a coinvolgimento polmonare. L ipotesi che la Timosina-beta4 possa esercitare un effetto cito-protettivo nel danno polmonare nasce dall osservazione che quando la concentrazione della proteina si abbassa si verifica una più veloce progressione dell interstiziopatia polmonare. Scopo di questa tesi è stato verificare i possibili effetti protettivi della Timosina-beta4 in un modello in vivo di fibrosi polmonare. Tali effetti risulterebbero particolarmente utili nella FPI, in particolare per rallentare la fase precoce del processo fibrotico, dove danni tissutali da ROS e da cellule infiammatorie concorrono attivamente all espressione del fenotipo fibrotico. Materiali e Metodi. In questo studio è stato utilizzato il modello murino, molto noto ed utilizzato, di danno polmonare indotto da Bleomicina,, anche se per un periodo limitato a 7 giorni. I topi appartenenti al ceppo C57BL/6 sono stati trattati con Bleomicina (BLEO 1 mg/Kg) in assenza e/o in presenza di Timosina-beta4 (6 mg/kg per via intraperitoneale dal giorno di trattamento con BLEO e per ulteriori due dosi). Dopo il sacrificio avvenuto una settimana più tardi, sono stati eseguiti: a) la misurazione del fluido e il contenuto di collagene del polmone; b) la conta cellulare e l analisi citobiologica differenziale nel lavaggio broncoalveolare (BAL); c) saggio per la misurazione dell attività mieloperossidasica; d) istologia polmonare; e) immunoistochimica (IHC); f) analisi al citofluorimetro (FACS) di cellule T estratte dal sangue periferico e dalla milza per la valutazione della percentuale di cellule positive per IL-17A, CD4, CD25 e Fox-p3. Risultati. Nei topi co-trattati con Timosina-beta4 è stato osservato un calo del peso corporeo meno evidente e un tasso di mortalità più basso rispetto ai topi trattati con BLEO. Inoltre, l infiammazione e il danno polmonare indotti da BLEO sono stati ridotti grazie al co-trattamento con Timosina-beta4, cosi come dimostrato dalla riduzione significativa di: a) edema; b) contenuto di collagene totale, c) infiltrazione leucocitaria polmonare; d) attività mieloperossidasica; e) danno al polmone evidenziato dall' analisi istologica. Inoltre, i risultati dell' IHC mostrano una più forte reattività alla Timosina-beta4, con evidente localizzazione alveolare, in topi trattati con la proteina esogena rispetto ai topi trattati solo con BLEO. L analisi al FACS mostra una ridotta percentuale di cellule T positive per IL-17A ed un aumento della percentuale di cellule positive per CD4,CD25 e Fox-p3 nei topi trattati con Timosina-beta4 rispetto ai topi trattati con BLEO. Conclusioni. Questo studio mostra un ruolo protettivo della Timosina-beta4 nel modello murino di danno polmonare indotto da Bleomicina e individua alcuni meccanismi immunologici che potrebbero determinarlo. Ulteriori studi sono necessari per valutare la durata degli effetti protettivi della Timosina-beta4 e il suo eventuale ruolo terapeutico.