Development of a new 3D ex vivo model of brain-leukemia interaction to study the role of Activin A in the Central Nervous System microenvironment

Central nervous system (CNS) acute lymphoblastic leukemia is a major clinical problem. Prophylactic therapy is neurotoxic, and a third of the relapses involve the CNS. In addition, new preclinical models are needed to study the interaction between leukemia cells and brain microenvironment. In this study, we established a new ex vivo model of cortical cerebral organotypic slices microinjected with leukemic cell line (NALM6-iRFP670) to study central nervous system microenvironment modifications by leukemia cells. We observed an exponential increase of iRFP670+ NALM-6 cells in the cortical slices up to 7d post- injection. Of note, pretreatment with Activin A significantly increased NALM6 proliferation after 5 and 7d compared to non-stimulated cells. Cortical slices injected with Activin A pretreated NALM6 cells (NALM6 Activin A) showed higher mortality 24h and 72h compared to cortical slices injected with non-stimulated NALM6 (NALM6 NS) and compared to non-injected slices (CTRL). By using CX3CR1+/GFP cortical slices, we observed an increased microglia activation in NALM6 Activin A slices at 72h, 5d and 7d post-injection compared to CTRL. Microglia morphological analysis showed a slight increase of round-shape in NALM6 Activin A slices compared to CTRL and to NALM6 NS slices at 72h. However, at 7d NALM6 Activin A slices showed an increased microglia cell area and perimeters, a reduced circularity and solidity and an increased aspect ratio and feret’s diameter. These modifications were associated with significant changes in gene expression, characterized by a down-regulation of microglial pro-inflammatory genes (iNOS, PAI-1) and an up-regulation of the anti-inflammatory ones (Arginase-1, CD206). At last, NALM6 Activin A slices showed significant reduction of GFAP gene expression at 72h compared to CTRL. Furthermore, the astrocyte morphology was found to be protoplasmic in both NALM6 NS and NALM6 Activin A slices as opposed to the fibrous one found in CTRL. Preliminary in vivo results indicated that leukemia is initially a leptomeningeal disease that induces Activin A production in the central nervous system. Overall, we efficiently set up an ex vivo model to study leukemia cell interactions with brain tissue. In addition, our data candidate Activin A as a key molecule involved in CNS microenvironmental modifications. In conclusion, Activin A pretreatment promotes higher NALM6 proliferation in organotypic cortical brain slices, modifying the cerebral milieu in favor of leukemic cell survival and proliferation. Our model can aid in answering important questions about brain changes after leukemic cell infiltration and could be used as useful tool for anti-cancer drug screening.

La leucemia linfoblastica acuta del sistema nervoso centrale (LLA-SNC) rappresenta un importante problema a livello clinico. La profilassi è neurotossica ed un terzo delle recidive coinvolge il SNC. Inoltre, è importante sviluppare nuovi modelli preclinici per studiare l'interazione tra cellule leucemiche e microambiente cerebrale. In questo studio abbiamo sviluppato un nuovo modello ex vivo di fettine organotipiche corticali cerebrali microiniettate con la linea cellulare leucemica NALM6, che esprime la proteina iRFP670, per studiare le modifiche del microambiente cerebrale indotte dalle cellule leucemiche. Abbiamo osservato un aumento esponenziale delle cellule NALM6-iRFP670 fino a 7 giorni dopo la microiniezione nel tessuto cerebrale. In più, il pretrattamento con Attivina di tipo A ha aumentato significativamente la proliferazione delle cellule NALM6 dopo 5 e 7 giorni rispetto alle cellule non trattate. Il pretrattamento con Attivina di tipo A è stato associato anche ad una maggiore mortalità delle fettine corticali dopo a 24 e 72 ore dopo la microiniezione. Utilizzando fettine corticali CX3CR1+/GFP, abbiamo osservato un aumento dell'attivazione della microglia nelle fettine corticali microiniettate con NALM6 pretrattate con Attivina di tipo A a 72 ore, 5 e 7 giorni dopo la microiniezione. L'analisi morfologica della microglia ha mostrato che, 72 ore dopo la microiniezione, le cellule NALM6 pretrattate con Attivina di tipo A hanno indotto un leggero aumento della microglia di forma rotonda rispetto ai controlli (CTRL) e alle fettine microiniettate con cellule NALM6 non trattate. Tuttavia, 7 giorni dopo la microiniezione, la microglia delle fettine corticali microiniettate con NALM6 pretrattate con Attivina di tipo A ha mostrato un aumento dell'area e dei perimetri cellulari, una ridotta circolarità e solidità, una polarizzazione e un diametro di Feret più elevati. Queste modifiche sono state associate a cambiamenti significativi nell'espressione genica, caratterizzati da una down-regolazione dei geni pro-infiammatori della microglia (iNOS, PAI-1) e da una up-regolazione di quelli anti-infiammatori (Arginase-1, CD206). Inoltre, nelle fettine microiniettate con cellule NALM6 pretrattate con Attivina di tipo A, abbiamo trovato livelli significativamente ridotti del GFAP a 72h dopo la microiniezione rispetto ai CTRL. Inoltre, la morfologia degli astrociti è risultata essere protoplasmica nelle fettine corticali microiniettate con cellule NALM6 stimolate e non con Attivina di tipo A rispetto alla forma fibrosa riscontrata nelle fettine CTRL. I risultati preliminari in vivo hanno indicato che la leucemia è inizialmente una malattia delle leptomeningi e che le cellule NALM6 inducono la produzione di Attivina di tipo A nel SNC. Concludendo, abbiamo messo a punto in modo efficiente un modello ex vivo per studiare le interazioni delle cellule leucemiche con il tessuto cerebrale. I nostri dati indicano che l'Attivina di tipo A può essere considerata una nuova molecola candidata nei cambiamenti microambientali del SNC. Inoltre, il pretrattamento con Attivina di tipo A promuove una maggiore proliferazione delle cellule NALM6 nelle fettine corticali rispetto alle cellule non trattate e, modifica l'ambiente cerebrale a favore della sopravvivenza e della proliferazione delle cellule leucemiche. Il nostro modello può aiutare a rispondere a importanti domande sui cambiamenti microambientali cerebrali dopo l'infiltrazione di cellule leucemiche e potrebbe essere utilizzato come strumento per lo screening di farmaci antitumorali.