Structural and functional analyses of an ice-binding protein from an Antarctic bacterium

Ice-binding proteins (IBPs) are characterized by the ability to control the growth of ice crystals. IBPs are active in increasing thermal hysteresis (TH) gap as they decrease the freezing point of water. On the other hand, IBPs can inhibit ice recrystallization (IRI) and stabilize small ice crystals at the expense of the harmful, large ones. IBPs have been identified in several organisms including higher Eukaryotes and microorganisms such as bacteria, yeasts and algae. Although IBPs share the ability to bind ice crystals, proteins from different sources present different 3D structures, from α-helix to β-solenoid proteins. This thesis is focused on the structural and functional characterization of EfcIBP, a bacterial IBP identified by metagenomic analysis of the Antarctic ciliate Euplotes focardii and the associated consortium of non-cultivable bacteria. The 3D structure of EfcIBP, solved by X-ray crystallography, consists in a β-solenoid with an α-helix aligned along the axis of the β-helix. It is possible to distinguish three different faces: A, B and C. Docking simulations suggest that B and C faces are involved in ice binding. This hypothesis was tested by the rational design of six variants that were produced and assayed for their activity. Overall, these experiments indicate that both solenoid faces contribute to the activity of EfcIBP. EfcIBP displays remarkable IRI activity at nanomolar concentration and a TH activity of 0.53°C at the concentration of 50 μM. The atypical combination between these two activities could stem from the ability of this protein to bind ice crystals through two faces of the solenoid. In the presence of EfcIBP, ice crystals show a hexagonal trapezohedron shape within the TH gap, and a unique “Saturn-shape” below the freezing point. A chimeric protein consisting of the fusion between EfcIBP and the green fluorescent protein was used to deeper investigate on this aspects by analyses of fluorescence ice plane affinity and binding kinetics. Overall, experimental data suggest that the EfcIBP unique pattern of ice growth and burst are due to its high rate of binding at the basal and the pyramidal near-basal planes of ice crystals. These data, together with the signal sequence for the secretion, suggest that EfcIBP is secreted in local environment where it becomes active in increasing the habitable space. In conclusion, EfcIBP is a new type of IBP with unusual properties of ice shaping and IRI activity. This study opens new scenarios in the field of IBPs by contributing to identify a new class of moderate IBPs potentially exploitable as cryoprotectants in several fields, such as cryobiology and food science.

Una proteina in grado di legare i cristalli di ghiaccio è definita proteina legante il ghiaccio o IBP acronimo dall’inglese ice-binding protein. Le IBP grazie alla loro capacità di abbassare il punto di congelamento dell’acqua, aumentando il gap di isteresi termica (TH). Questo intervallo è definito come la differenza tra il punto di fusione e di congelamento dell’acqua. La seconda attività delle IBP è l’inibizione della ricristallizzazione del ghiaccio (ice recrystallization inhibition, IRI). Infatti, queste proteine stabilizzano i piccoli cristalli di ghiaccio impedendo la formazione di cristalli di ghiaccio di grosse dimensioni che sono dannosi per le cellule. Le IBP sono state identificate in numerosi organismi tra cui pesci, insetti, batteri, alghe e lieviti. Queste proteine rappresentano un esempio di evoluzione convergente, infatti tutte le IBP condividono lo stesso meccanismo di legame con il ghiaccio nonostante una sorprendente diversità strutturale e funzionale. Questo lavoro di tesi è focalizzato sulla caratterizzazione funzionale e strutturale di EfcIBP, una IBP batterica identificata da analisi di metagenomica effettuate sul ciliato Antartico Euplotes focardii e sul consorzio batterico ad esso associato. La struttura 3D di EfcIBP è stata risolta mediante cristallografia ai raggi X e consiste in un β-solenoide con un α-elica parallela all’asse principale della proteina. L’analisi strutturale ha permesso di identificare tre diverse facce del solenoide denominate A, B e C. Simulazioni di docking suggeriscono che EfcIBP è in grado di legare i cristalli di ghiaccio tramite le facce B e C del solenoide. Questa ipotesi è stata verificata attraverso la progettazione razionale di 6 varianti che sono state prodotte e saggiate per la loro attività. In generale, questi risultati indicano che EfcIBP è in grado di legare i cristalli di ghiaccio attraverso le facce B e C del solenoide. Questa peculiarità strutturale si riflette in un’insolita combinazione di attività di IRI e TH. Infatti, EfcIBP presenta una notevole attività di IRI in un intervallo di concentrazione nanomolare e una attività di isteresi termica di 0.53°C alla concentrazione di 50 μM che la rende una IBP moderata. All’interno del gap di TH, i cristalli di ghiaccio presentano una forma esagonale, mentre a temperature al di sotto della temperatura di congelamento presentano una forma a “Saturno". La proteina chimerica formata dalla “green fluorescent protein” e da EfcIBP è stata utilizzata per determinare a quali piani del cristallo di ghiaccio la proteina è in grado di legarsi e con quale cinetica. I dati sperimentali suggeriscono che le peculiarità funzionali di EfcIBP sono dovute alla sua capacità di legare velocemente i piani basali e piramidali del cristallo di ghiaccio. Questi dati, insieme alla presenza di una sequenza segnale per la secrezione, suggeriscono che EfcIBP è secreta e svolge la funzione di mantenere liquido l’ambiente circostante aumentando lo spazio vitale. In conclusione, EfcIBP è un nuovo tipo di IBP con proprietà insolite di legame al ghiaccio e di attività di IRI. Questo studio ha contribuito ad identificare una nuova classe di IBP moderate che potrebbero essere sfruttate come crioprotettori in diversi settori come la criobiologia e quello alimentare.