Approfondimento del potenziale terapeutico di alcuni ceppi di Cutibacterium acnes e loro applicabilità alle patologie infiammatorie della pelle associate a disbiosi

The skin is the largest organ of the human body consisting of a multilayer structure with several features ranging from protection to thermoregulation. The stratum corneum and tight junctions shape a protective barrier against external agents aggression. In this scenario, the skin microbiota together with these two components plays a crucial role to ensure and manteining the skin homeostasis. Epidermal differentiation alterations along with the microbiota perturbation (dysbiosis) led to the skin barrier destroy and the diseases occurrence. In this PhD project, the potential of Cutibacterium acnes derivatives and their applicability as useful therapeutic agents for the treatment of inflammatory skin diseases associated with dysbiosis was investigated. The screening was conducted on three derivatives (heat-killed bacteria, supernatant and fragment c40) of various C. acnes strains witch revealed a marked activity against the skin pathogens tested. Therefore, subsequent experiments were conducted on c40 fragment alone and hyaluronic acid conjugated (HAc40), due to its moisturising and humectant properties. In vitro test on HaCaT-immortalised human keratinocytes demonstrated that Staphylococcus aureus ATCC29213 pre-incubation and DSM20491 coincubation, with HAc40, reduced pathogen adhesion/invasion. Furthermore, c40 and HAc40 alone promoted keratinocyte proliferation of S. aureus ATCC29213 and DSM20491 infected cells. Skin biopsies of Sus scrofa infected with S. aureus and the DSM20491 α-toxin were analysed by eosin haematoxylin staining in order to study the stratum corneum damage. All tissues pre-treated or co-incubated with the c40 and HAc40 suspensions show a normal skin with morphological features similar to the control. Pig sections stained with immunofluorescence for two tight junction proteins (namely Claudin1 and ZO1), demonstrated a loss of signal for both S. aureus infected tissues and DSM20491 α-toxin suggesting that host-pathogen interactions in the skin infection are primarily directed to the TJs. All tissues infected with S. aureus ATCC29213 and treated with c40 and HAc40 had a signal comparable to the control for both Claudin and ZO1 suggesting that c40 and HAc40 could protect from tissues damage. Conversely, tissues pre-incubation with c40 and HAc40 or co-incubation with HAc40 protected more from skyn damage compared to previous treatment. Lastly, supernatant pre-incubation and c40 or HAc40 incubation demostrated the higther damage protection. In conclusion, our study results proved that c40 and HAc40 both in vitro and ex vivo were active on S. aureus, suggesting that the HAc40 component is able to interfere with the bacterial mechanism of keratinocyte adhesion and invasion preserving the tight junction damage. These results encourage further study for the development of new medical device for dermatological pathologies.

La pelle è l'organo più esteso del corpo umano composto da una struttura multistrato in cui lo strato corneo e le giunzioni strette (TJ) formano una barriera protettiva contro le aggressioni dagli agenti esterni. Anche il microbiota cutaneo coopera con queste due componenti per garantire il mantenimento di una condizione di omeostasi. Alterazioni nella differenziazione epidermica e nella composizione della comunità microbica cutanea (disbiosi) provocano la distruzione della barriera determinando l’insorgenza di malattie. In questo progetto di dottorato è stato investigato il potenziale di alcuni derivati di Cutibacterium acnes e la loro applicabilità come agenti terapeutici utili al trattamento delle patologie infiammatorie della pelle associate a disbiosi. Lo screenening condotto su tre derivati (heat klled bacteria, surnatante e frammento c40) di vari ceppi di C. acnes ha evidenziato una spiccata attività sui patogeni cutanei testati da parte del C. acnes DSM 28251. Pertanto, gli esperimenti successivi, sono stati condotti sul frammento c40 da solo e coniugato all’acido iaulronico (HAc40) in virtù delle sue proprietà idratanti e umettanti. Dagli esperimenti condotti in vitro sui cheratinociti umani immortalizzati HaCaT, è emerso che la preincubazione di Staphylococcus aureus ATCC29213 e, nel caso del ceppo DSM20491 anche la coincubazione con l’HAc40, riducono con valori statisticamente significativi l’adesione/invasione del patogeno alle cellule. Inoltre, il c40 e l’HAc40 promuovono la proliferazione dei cheratinociti ed infatti, le cellule infettate con S. aureus ATCC 29213 o trattate con il surnatante del ceppo DSM20491 (contenente l’α tossina) ma coincubate con le sospensioni test, sebbene presentino una capacità proliferativa inferiore rispetto al controllo non trattato, migrano molto più rapidamente rispetto a quelle solamente infettate. Le biopsie di cute di Sus scrofa infettate con S. aureus e il surnatante e analizzate mediante colorazione eosina ematossilina rivelano che sia il patogeno che la tossina contenuta nel surnatante danneggiano lo strato corneo. Viceversa tutti i tessuti pretrattati o co-incubati con le sospensioni c40 e HAc40 mostrano una cute normo-conformata con tratti morfologici simili a quelli del controllo. Le stesse sezioni colorate con immunofluorescenza per due delle proteine delle giunzioni tight (Claudina1 e ZO1), hanno evidenziato una perdita di segnale per i tessuti infettati con il patogeno e con il surnatante suggerendo che le interazioni ospite-patogeno nell'infezione cutanea da S. aureus sono principalmente dirette alle TJ. Tutti i tessuti infettati con S. aureus ATCC29213 ma trattati con c40 e HAc40 sembrano essere protetti dal danno facendo registrare un segnale comparabile al controllo sia per Claudina che per zo1. Al contrario la preincubazione dei tessuti con c40 e HAc40 e la co-incubazione con HAc40 ha protetto maggiormente dal danno da S. aureus DSM20491. Infine anche nel caso del surnatante la preincubazione con 40 e la coincubazione con c40 e HAc40 si sono rivelati i trattamenti migliori. In conclusione i risultati ottenuti dal nostro studio hanno dimostrato che c40 e HAc40 sia in vitro che ex vivo si sono rivelati attivi su S. aureus suggerendo che suggerendo che il componente HAc40 è in grado di interferire con il meccanismo di adesiome e invasione dei cheratinociti e di preservare l’epidermide dal danno alle tight junction, i principali meccanismi utilizzati da S. aureus per promuovere la distruzione della barriera cutanea. Questi risultati incoraggiano lo studio per lo sviluppo di un nuovo dispositivo per il trattamento delle patologie dermatologiche.