APPLICATION OF MOLECULAR TECHNIQUES IN STUDYING RUMEN MICRORGANISMS IN VITRO

L’obiettivo generale di questa tesi è lo studio della popolazione microbica dei ruminanti in sistemi fermentativi in vitro. L’innovazione consiste nell’impiego di metodi molecolari come strumenti aggiuntivi nei sistemi in vitro sui ruminanti, finalizzato allo studio del processo di fermentazione. Tali strumenti permettono una maggiore comprensione di un ecosistema microbico complesso come quello dei ruminanti e conseguono misurazioni dirette della loro attività microbica. La tesi comprende i risultati di quattro esperimenti. Il primo esperimento analizza la metodologia di estrazione del DNA, in quanto processo critico di qualsiasi analisi molecolare. In questa fase sono stati comparati due metodi comunemente utilizzati per l’estrazione del DNA: il QIAamp® DNA Stool Mini Kit e il fenolo cloroformio. I risultati hanno dimostrato che il Kit produce una migliore resa, qualità e ripetibilità del DNA rispetto al secondo metodo. In base ai risultati ottenuti proponiamo un metodo che coniughi i vantaggi di entrambi. Il secondo esperimento osserva i cambiamenti nella popolazione batterica utilizzando metodi molecolari in vitro, ferme restando due differenze: la fonte del fluido del ruminante e il tipo di substrato. Tra le misurazioni tradizionali della fermentazione (acidi grassi volatili e degradabilità NDF) e i risultati ottenuti attraverso l’analisi molecolare della popolazione batterica (ad esempio QPCR) si è osservata una buona conformità. Il risultato è particolarmente rilevante perché evidenzia la difficoltà di scegliere un gruppo o una specie microbiologica come microrganismo di riferimento, visto che un effetto apprezzabile in un gruppo o specie potrebbe benissimo non esserlo in un altro. Inoltre i risultati dimostrano che i metodi molecolari possono essere utilizzati insieme a metodi convenzionali di misurazione della fermentazione microbica. Il terzo esperimento vuole applicare metodi molecolari per comprendere la degradazione delle fibre nel ruminante. A questo scopo si è utilizzato il loglio perenne appena tagliato e incubato in sacco, analizzandolo con metodi molecolari e con il microscopio elettronico a bassa scansione per studiare i microbi attaccati. La diversità batterica è stata studiata usando il DGGE; la popolazione batterica con il QPCR e il microscopio elettronico a bassa scansione per studiare dal punto di vista visivo le specie batteriche considerate. I risultati ottenuti mettono in evidenza un rapido aumento nel totale dei batteri attaccati Prevotella spp., Ruminococcus albus and R. flavefaciens, fino a otto ore. L’analisi del DGGE ha successivamente rivelato che i batteri attaccati sono presenti solo per brevi periodi di tempo. 7 Il quarto esperimento utilizza il loglio perenne incubato in vitro allo scopo di studiare l’effetto del tannino sulla colonizzazione batterica del fieno di loglio italiano attraverso l’applicazione di metodi molecolari. Per osservare la popolazione dei microbi attaccati si è ricorsi alle analisi TRFLP, valutando due enzimi di restrizione: HaeIII and MspI. Il primo ha dato un risultato maggiore rispetto al secondo ed è per questo consigliato negli esperimenti in vitro. Come rivelano i risultati del QPCR, il tannino aggiunto ha un effetto in vitro sui microbi cellulosolitici (R. flavefaciens e F. Succinogenes) attaccati al fieno incubato quattro ore dopo l’incubazione. Sorprendentemente non si è evidenziata alcuna variazione significativa in tutta la colonia batterica né nella sua degradazione. Tali risultati suggeriscono una sostanziale resilienza, una comunità microbica complessa ma stabile in cui la perdita di una popolazione non comporta automaticamente grandi variazioni nell’aderenza delle fibre e nel complessivo microbioma dei ruminanti.